四、鸡传染性支气管炎

鸡传染性支气管炎的主要传播方式是病鸡从呼吸道排出病毒，经空气飞沫传染给易感鸡，此外可通过被污染的饲料、饮水、笼具等经消化道传染。过热、严寒、拥挤、通风不好及维生素、矿物质供应不足均可促使本病发生。本病是由病毒引起鸡发生的一种急性、高度接触传染性呼吸道疾病。其特征是呼吸型表现病鸡咳嗽、喷嚏和气管发生啰音；生殖道型表现产蛋鸡产蛋减少和质量差；肾病变型表现为肾脏肿大，有尿酸盐沉积；腺胃型表现腺胃出血，坏死，病鸡消瘦。该病具有高度的传染性，因病原血清型较多，使免疫接种复杂化。感染鸡生长受阻，饲料消耗增加、产蛋和蛋质下降、死淘率增加，给养鸡业造成巨大的经济损失。

（一）病原特征

鸡传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus，IBV）属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）的一个代表种。多数呈圆形，直径80～120nm。基因组为单股正链RNA，长为27kb。病毒粒子带有囊膜和纤突。病毒主要存在于病鸡呼吸道渗出物中，肝、脾、肾和法氏囊中也能发现病毒。在肾脏和法氏囊内停留时间可能比肺和气管中还要长。

IBV用病毒中和试验分为很多血清型。有人认为主要的血清型是Massachusetts41和Connecticut（M41、C型），其他为变异型。我国主要是M41型。引起肾病变的IBV株有澳大利亚T株，美国主要是Gray和Holte株，意大利为11731株。对肾的致病性T株是100%、Holte株为90%、Gray株为85%、M41株为20%。各血清型间没有或仅有部分交叉免疫作用。

鸡传染性支气管炎病毒除血清型很复杂外，其致病型（生物型）也不尽相同，现有呼吸型、肾病变型、生殖道型，1995年在我国出现的腺胃型等。致病型与血清型没有相关性，不同致病型的鸡传染性支气管炎病毒其血清学相关性可能很远，也可能很近，而相同致病型的鸡传染性支气管炎病毒其血清学相关性可能很远，也可能很近。此外，冠状病毒很容易发生变异，包括血清型的变异和致病型的变异。有证据表明在混合感染的情况下，IBV可以发生重组，因此很容易出现新的血清型或基因型，甚至是新的致病型。

病毒能在10～11日龄的鸡胚中生长，初次接种鸡胚，多数鸡胚能存活，少数生长迟缓。随继代次数增加，可增强对鸡胚的毒力，引起80%的鸡胚死亡。特征性变化是：发育受阻、胚体萎缩。感染鸡胚尿囊液不凝集鸡红细胞，但经1%胰酶或磷酸酶C处理后，则具有血凝性。病毒还可在鸡胚肾、肺、肝细胞培养上生长，也可在传代细胞（Vero）中连续传代。常用鸡胚肾细胞，多次继代后可产生细胞病变，表现为细胞质融合，形成合胞体，继而细胞坏死。相应的抗血清能抑制病毒的致细胞病变作用。

病毒对外界环境因素抵抗力不强，多数病毒株在56℃15min灭活，－20℃可保存7年之久。病毒对一般消毒剂敏感，如在0.01%高锰酸钾中3min内死亡。病毒在室温中能抵抗1%HCl（pH2）、1%苯酚和1%NaOH（pH12）1h。

（二）临床症状

本病自然感染的潜伏期为36h或更长一些。本病的发病率高，雏鸡的死亡率可达25%以上，但6周龄以上的死亡率一般不高，病程一般多为1～2周。雏鸡、产蛋鸡、呼吸型、生殖道型、腺胃型、肾病变型的症状不尽相同，现分述如下：

1.雏鸡

无前驱症状，全群几乎同时突然发病。最初表现呼吸道症状，流鼻涕、流泪、鼻肿胀、咳嗽、打喷嚏、伸颈张口喘气。夜间听到明显嘶哑的叫声。随着病情发展，症状加重，缩头闭目、垂翅挤堆、食欲不振、饮欲增加，如治疗不及时，有个别死亡现象。

2.产蛋鸡

表现轻微的呼吸困难、咳嗽、气管啰音，有“呼噜”声。精神不振、减食、拉黄色稀粪，症状不很严重，有极少数死亡。发病第2天产蛋开始下降，1～2周下降到最低点，有时产蛋率可下降一半，并产软蛋和畸形蛋，蛋清变稀，蛋清与蛋黄分离，种蛋的孵化率也降低。产蛋量回升情况与鸡的日龄有关，产蛋高峰的成年母鸡，如果饲养管理较好，经两个月基本可恢复到原来水平，但老龄母鸡发生此病，产蛋量大幅下降，很难恢复到原来的水平，可考虑及早淘汰。

3.肾病变型

多发于20～50日龄的幼鸡。在感染肾病变型的传染性支气管炎毒株时，由于肾脏功能的损害，病鸡除有呼吸道症状外，还可引起肾炎和肠炎。肾型支气管炎的症状呈二相性：第一阶段有几天呼吸道症状，随后又有几天症状消失的“康复”阶段；第二阶段就开始排水样白色或绿色粪便，并含有大量尿酸盐。病鸡失水，表现虚弱嗜睡，鸡冠褪色或呈紫蓝色。肾病变型传染性支气管炎病程一般比呼吸器官型稍长（12～20d），死亡率也高（20%～30%）。

4.呼吸型

潜伏期36h或更长，人工感染为18～36h。病鸡突然出现呼吸症状，并迅速波及全群。4周龄以下鸡常表现伸颈、张口呼吸，喷嚏、咳嗽，有呼吸啰音，病鸡全身衰弱，精神不振（图1-16），食欲减少，羽毛松乱，昏睡、翅下垂。常拥挤在一起。个别鸡鼻窦肿胀，流黏性鼻汁，眼泪多，逐渐消瘦。康复鸡发育不良。

5～6周龄以上鸡，突出症状是啰音、气喘和微咳，同时伴有减食、沉郁或下痢症状。

病程一般为1～2周，有的拖延至3周。雏鸡的死亡率可达25%，6周龄以上的鸡死亡率很低。

5.生殖道型

出现轻微的呼吸道症状，产蛋鸡产蛋量下降，并产软壳蛋、畸形蛋或粗壳蛋（图1-17）。蛋的质量变差，如蛋白稀薄呈水样，蛋黄和蛋白分离以及蛋白黏着于壳膜表面等。

6.腺胃型

呼吸道症状轻微或不出现，病鸡沉郁、减食、羽毛蓬乱、腹泻、迅速消瘦、体重减轻。

（三）病理变化

1.呼吸型

气管、支气管、鼻腔和窦内有浆液性、卡他性和干酪样渗出物（图1-18）。气囊混浊含有黄色干酪样渗出物。在病死鸡的气管式支气管中可见有干酪样渗出物。

2.生殖道型

产蛋母鸡的腹腔内可以发现液状的卵黄物质，卵泡充血、出血、变形。18日龄以内的幼雏，有的见输卵管发育异常，致使成熟期不能正常产蛋。

3.肾病变型

病鸡消瘦，脱水，肾肿大出血，呈斑驳状的“花斑肾”（图1-19），肾小管和输尿管因尿酸盐沉积而扩张。在严重病例，白色尿酸盐沉积可见于其他组织器官表面。

4.腺胃型

病鸡消瘦，腺胃肿大出血，黏膜有溃疡、坏死。

（四）流行病学特征

本病仅发生于鸡，但小雉可感染发病，其他家禽均不感染。各种年龄的鸡都可发病，但雏鸡最为严重。有母源抗体的雏鸡有一定抵抗力（约4周）。适应于鸡胚的毒株脑内接种乳鼠，可引起乳鼠死亡。

病鸡和带毒鸡是本病主要的传染源。病毒存在于呼吸道、消化道、生殖道的分泌液中，排出病毒，污染的垫料、饲料和饮水，可成为传播媒介，病鸡康复后可带毒49d，在35d内具有传染性。传播途径主要是呼吸道，主要传播方式是病鸡从呼吸道排出病毒，经空气飞沫传染给易感鸡。此外，通过污染的饲料、饮水可经消化道传染，也可经蛋垂直传播。

呼吸型呈流行性发生，传播迅速，发病率可达100%，肾型与腺胃型流行缓慢，常发生于20～80日龄鸡，生殖道型发生于产蛋鸡。过热、严寒、拥挤、通风不良，维生素、矿物质和其他营养物质缺乏以及疫苗接种等均可促进本病的发生。

（五）预防及治疗

预防本病应考虑减少诱发因素，提高鸡只的免疫力。清洗和消毒鸡舍后，引进无传染性支气管炎病疫情鸡场的鸡苗，搞好雏鸡饲养管理，鸡舍注意通风换气，防止过于拥挤，注意保温，适当补充雏鸡日粮中的维生素和矿物质，制定合理的免疫程序。

疫苗接种是预防传染性支气管炎的一项主要措施。用于预防传染性支气管炎的疫苗种类很多，可分为灭活苗和弱毒苗两类。

灭活苗：采用本地分离的病毒株制备灭活苗是一种很有效的方法，但由于生产条件的限制，未被广泛应用。

弱毒苗：单价弱毒苗应用较为广泛的是荷兰引进的H120、H52株。H120对14日龄雏鸡安全有效，免疫3周保护率达90%；H52对14日龄以下的鸡会引起严重反应，不宜使用，但对90～120日龄的鸡却安全，故常用的程序为H120于10日龄、H52于30～45日龄接种。

新城疫、传染性支气管炎的二联苗由于存在着传染性支气管炎病毒在鸡体内对新城疫病毒有干扰的问题，所以在理论和实践上对此种疫苗的使用价值一直存有争议，但由于使用上较方便，并节省资金，故应用者也较多。

对传染性支气管炎尚无有效的治疗方法，人们常用中西医结合的对症疗法。由于实际生产中鸡群常并发细菌性疾病，故采用一些抗菌药物有时显得有效。对肾病变型传染性支气管炎的病鸡，有人采用口服补液盐、0.5%碳酸氢钠、维生素C等药物能起到一定的效果。

（1）发病时，可用龙达三肽，每套可注射1000羽成禽、2000羽初禽，一般注射一次即可。饮水，每套500羽成禽、1000羽初禽，集中3～4h饮完，一般饮水一次即可，病情严重者饮水两天，一天一次。并用抗菌药物防止继发感染。饲养管理用具及鸡舍要进行消毒。病愈鸡不可与易感鸡混群饲养。

（2）咳喘康，开水煎汁半小时后，加入冷开水20～25kg作饮水，连服5～7d。同时，每25kg饲料或50kg水中再加入盐酸吗啉胍原粉50g，效果更佳。

（3）每克强力霉素原粉加水10～20kg任其自饮，连服3～5d。

（4）每千克饲料拌入病毒灵1.5g、板蓝根冲剂30g，任雏鸡自由采食，少数病重鸡单独饲养，并辅以少量雪梨糖浆，连服3～5d，可收到良好效果。

（5）咳喘敏、阿奇喘定等有特效。

（六）实验室检测

1.微量血凝抑制试验

（1）范围　本方法规定了鸡传染性支气管炎微量血凝抑制试验，适用于鸡传染性支气管炎的诊断和免疫抗体检测。

（2）微量血凝抑制试验

1）试剂　抗原与标准阳性血清，由指定单位提供，按说明书使用。

稀释液［pH7.4磷酸缓冲盐水（PBS）］，阿氏液（Alsever），配制方法见附录A。

2）器材　微量反应板：96孔，V形底，同一次试验使用的反应板孔底角度应相同。

3）操作方法

① 微量血凝试验

a.于V形血凝板的每孔中滴加PBS 25μl，共滴4排。

b.吸取抗原滴加于第一列孔，每孔25μl，然后按由左到右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取25μl弃之。最后一列不加抗原作对照。各孔补加PBS 25μl。

c.于每孔加入1%红细胞悬液25μl，置微量振荡器上振荡1min。

d.放室温下（22～25℃）40min后根据血凝图像判定结果。

e.凝集程度的判定

完全凝集（++）：V形孔的尖部无红细胞沉淀块。

不完全凝集（+）：V形孔的尖部有较明显的红细胞沉淀块，但整个孔底散布较多的凝集红细胞。

不完全沉淀（±）：V形孔的尖部有较多的沉淀红细胞，孔底其他部分有少量凝集红细胞散布。

完全沉淀（－）：红细胞都沉积于V形孔的尖部，孔底其他部分无可见的红细胞。

f.以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次做四排，以几何均值表示结果。

g.计算出含4个血凝单位的抗原浓度，将血凝滴度除以4即为4个血凝单位的抗原应稀释的倍数。

② 微量血凝抑制试验

a.取25μl PBS分别加入V形96孔微量血凝板的各孔内。

b.吸取被检血清25μl于第1孔中，混匀后吸25μl于第2孔，依次倍比稀释至第11孔，最后弃去25μl。

c.除第1列孔不加抗原外，吸取4个血凝单位的抗原25μl加入第2～12列各孔。

d.置室温下感作30min。

e.加25μl 1%红细胞悬液于各孔中，振荡混匀后，室温下静置40min，判读结果。

f.第1列孔为血清对照孔，第12列为抗原对照孔，每次测定还应设已知滴度的标准阳性血清作对照。

g.判定

红细胞凝集程度的判定：同①、e的判定。

血凝抑制试验结果的判定：在抗原对照出现完全凝集、血清对照出现完全沉淀的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数为该血清的血凝抑制滴度。若鸡群没有接种过鸡传染性支气管炎疫苗，且有的鸡血清滴度达到4log2以上，说明鸡群已受传染性支气管炎的感染。

2.病原的分离

（1）样品的采集

1）对于急性呼吸道型的病鸡，应采取气管渗出物；对于刚扑杀的病鸡则采取支气管和肺组织。

2）对于肾型和产蛋下降型的病鸡，应采取发病鸡的肾脏或输卵管。也可从大肠，尤其是盲肠扁桃体或粪便中分离病毒，但从消化道分离到的病毒未必与现流行或发生的病毒有直接关系。

（2）样品的处理

1）将样品放在含有10000IU/ml青霉素和10mg/ml链霉素的pH7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）内，置冰盒内送往实验室。pH 7.4的PBS的配方见附录A。

2）将病料磨碎，加含抗生素的PBS制成体积分数为20%的组织悬液，冻融3次，以3000g离心20min，取上清液，加入终浓度为1000IU/ml的青霉素和终浓度为1mg/ml的链霉素，37℃下作用1h后用于鸡胚接种。

（3）分离培养

1）取病料上清液，接种于5枚9～11日龄的SPF鸡胚尿囊腔内，另取5枚接种PBS，接种量均为0.2ml/枚。37℃孵育。每天照蛋，24h内死亡的鸡胚弃去。收集接种后3～7d的鸡胚尿囊液，将所有尿囊液混合，用1000IU/ml青霉素和1mg/ml链霉素的PBS稀释5～10倍，继续在鸡胚内传代。典型的野毒株通常在鸡胚中传至第2代或第3代时，可见侏儒胚，传至第3代，某些鸡胚可出现死亡。含毒尿囊液置－60℃以下可长期保存，也可以冻干4℃保存。

2）将分离物经鸡胚传3代或3代以上，收获接种后7d仍存活的鸡胚，取胎儿，用剪刀剪除胎儿体外的附属物，并用吸水纸吸干胎儿表面的液体。如接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2g以上者，可初步判定为有病毒感染。

3）对病毒的进一步鉴定可通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）进行。

3.反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

（1）核酸抽提

1）材料准备

① 被检样品：所采集的病料（肺或肾等组织样品、棉拭子、尿囊液和细胞培养物）应新鲜，或者置于－20℃或－70℃低温冰箱保存。

a.组织样品的处理：往1～3g肺脏或肾脏等组织样品中加灭菌的0.85%生理盐水研磨成5～10倍悬浮液，反复冻融2～3次后，以4000g离心10min后取上清液作核酸提取用。

b.棉拭子的处理：将棉拭子充分捻动拧干后弃去，0.5ml样品液经4000g离心10min取上清液作核酸提取用。

c.细胞培养物：取1ml细胞培养物反复冻融2～3次后，以4000g离心10min后取上清作核酸提取用。

d.阴性尿囊液：10日龄SPF鸡胚尿囊液。

e.阳性病毒液：传染性支气管炎病毒M41株接种10日龄SPF鸡胚，孵育48h后收获尿囊液。

② 异丙醇

③ 灭菌1.5ml离心管

④ 无RNA酶水

⑤ 三氯甲烷（分析纯）

⑥ 无RNA酶水配制的75%乙醇溶液

2）操作方法

① 取100μl①、b.中的上清液或尿囊液置于一灭菌的1.5ml离心管中，同时设立阴性尿囊液或隐性细胞培养液和传染性支气管炎病毒M41株阳性病毒液为对照，再分别加入900μl冰冷的裂解液，剧烈混合样品15s，室温放置5min。

② 加入200μl三氯甲烷，颠倒离心管混合2次，剧烈混合10s，4℃下以10000g离心15min。

③ 吸取500μl上层水相于新的1.5ml灭菌离心管中，加入500μl异丙醇，4℃放置10min。4℃以下10000g离心15min。

④ 小心弃去全部上清液，加入1ml无 Rnase水配制的75%乙醇溶液，上下轻缓颠倒两次，4℃下以7500g离心5min。

⑤ 弃去全部上清，风干5～10min，即制得RNA。

（2）反转录（RT）

1）材料准备

① 反转录酶（reverse transcriptase）XL（AMV），核糖核酸酶抑制剂（Rnasin）和反转录引物。反转录引物为6个碱基长度的随机引物，序列为5’d（NNNNN）3’，其中N代表碱基中的A或C或G或T。

② 10 mmol/L DNTPS

③ 0.5ml灭菌PCR管

2）操作方法

① 在一个洁净的0.5ml灭菌PCR管中依次加入5×AMV缓冲液2μl、10 mmol/L DNTP0.5μl、反转录引物20pmol、核糖核酸酶抑制剂（Rnasin）10U，反转录酶AMV2.5U，用无RNase水补足总体积至25μl，轻缓混匀。

② 用①中的反转录混合液重悬（1）、2）、⑤中制备的RNA，置于室温10min。

③ 放入42℃水浴1h，取出冰浴2min，所得的反应液即为反转录产物cDNA。然后将cDNA置于－20℃保存或直接做PCR。

（3）核酸扩增

1）材料准备

① Taq酶，2.5mmol/L DNTPS，100bp DNA分子质量标准。

② PCR混合引物4PS：包括两对引物（Ms/Mx和3’s/3’x），分别针对传染性支气管炎病毒（IBV）基因组的M基因及基因组3’末端的非编码区，这两个基因区间保守性强。在该混合引物中，Mx/Ms浓度为4pmol/μl，3’s/3’x浓度为5pmol/μl。引物序列如下。

－3’s：5’ GGA AGA TAG GCA TGT AGCTT3’（20nt）。

－3’x：5’CTA ACT CTA TAC TAG CCT AT3（20nt）。

－MS：5’CCT AAG AAC GGI TGG AAT3’（18nt）。

－MX：5’TAC TCT CTA CAC ACA CAC 3’（18nt）。

③ 0.5ml灭菌离心管。

④ 2.0%琼脂糖凝胶（含0.5μl/ml溴化乙锭），配制方法见附录A。

2）操作方法

① 在一个洁净的0.5ml灭菌PCR管中依次加入无RNase水18.5μl、10×PCR缓冲液2.5μl、2.5mmol/L dNTPs2ΜL、4PS PCR混合引物1.5μl、2.5UTaq酶0.5μl，轻缓混匀。

② 加入2μl（2）、2）、③中制备的cDNA，轻缓混匀。

③ 置于PCR仪中运行，94℃3min，94℃40s，53℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，7min。同时设立以传染性支气管炎病毒M41株的cDNA为模板的阳性对照。

④ PCR产物的检测：待PCR反应结束后，每个PCR样品取5μl于含0.5μl/ml EB的2.0%琼脂糖凝胶孔中电泳，同时加入5μl标准100bpDNA分子量标准物作为参照。在75V恒压电泳30min，取凝胶置于紫外灯下观察或成像。

（4）检测与判定

1）阳性对照在约740bp和290bp处分别有一条特异的DNA条带，阴性对照则无相应的特异条带出现，则实验成立。

2）待检样品在相应位置如出现特异性条带，或者仅在约740bp处出现条带或者仅在290bp处出现特异条带，则均可判为阳性。

附录A

（规范性附录）

试剂配制

A.1　pH7.4磷酸缓冲盐水（PBS）的配制

磷酸氢二钠　　　　　　　　　　　　29.02g

磷酸二氢钠　　　　　　　　　　　　2.96g

氯化钠　　　　　　　　　　　　　　8.5g

取上述试剂溶于1000ml蒸馏水中，68.94kPa灭菌15min，4℃保存。

A.2　2.0%琼脂糖凝胶

在100ml TAE缓冲液（0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA）中加入2.0g琼脂糖，融化后加入溴化乙锭（EB）至终浓度0.5μg/ml后即可灌制凝胶。

A.3　阿氏（Alsevers）液配制

葡萄糖　　　　　　　　　　　　　　2.25g

柠檬酸三钠　　　　　　　　　　　　0.91g

柠檬酸　　　　　　　　　　　　　　0.06g

氯化钠　　　　　　　　　　　　　　0.42g

加蒸馏水至100ml，分装，90kPa20min高压灭菌，4℃保存备用。