4.4.3　基于宏基因组的关键化合物代谢网络途径构建

4.4.3.1　关键化合物形成与功能微生物关联分析

黄酒的风味物质主要来源于黄酒酿造原料、发酵过程中微生物代谢、煎酒和贮存过程中的物化反应等。根据文献及功能注释数据库，对黄酒中淀粉和纤维素降解，葡萄糖和氮利用，氨基酸、醇类、酸类、酯类和酚类等物质形成途径涉及的催化酶进行搜集和整理，共整理了223类催化酶。

在4个黄酒酿造过程发酵醪样品中，与风味形成相关的酶和物种的关联情况如图4-14和图4-15。对参与风味形成的功能微生物分析，发现功能酶的绝对丰度与微生物在黄酒中的丰度有关。根据催化酶的预测结果，发现对于作用同一催化反应的酶，多注释到具有广泛底物特异性的酶类，较少注释到底物专一的酶类。从预测的催化酶和功能微生物的数目上，发现注释到风味形成相关酶数目最多的10个属依次为曲霉属、糖多孢菌属、酵母属、葡萄球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、链霉菌属、拟无枝酸菌、多孢放线菌、笄霉属，除笄霉属外的9个属也是黄酒发酵过程平均相对丰度最高的9个属；139类催化酶中注释到微生物属数目前十的酶依次为EC 1.1.1.-、EC 1.1.1.1、EC 1.2.4.1、EC 2.1.1.14、EC 2.2.1.6、EC 2.3.1.9、EC 3.2.1.21、EC 3.5.1.4、EC 4.3.1.19、EC 6.4.1.2、fabF（EC 2.3.1.179）、fabG（EC 1.1.1.100）、fabH（EC 2.3.1.180）、fas（EC 2.3.1.-），主要是与醇类物质和酸类物质代谢相关的催化酶。

糖多孢菌属是黄酒发酵及麦曲中优势菌种之一，但目前糖多孢菌属在黄酒发酵过程中的具体作用尚未明确，从注释结果分析，发现糖多孢菌属可能与葡萄糖利用、氮利用、氨基酸合成、脂肪酸合成、甘油三酯水解有重要联系，而与乙醇、杂醇、酚类生成的关系较小。酵母菌是黄酒发酵中产乙醇的主要微生物，与乳酸代谢、氨基酸合成、杂醇生成、酯类物质合成、甘油三酯水解有重要联系。曲霉属在黄酒发酵中主要起糖化液化作用，根据注释信息发现曲霉属注释到的功能酶丰度较低，但注释到的功能酶种类最多，共涉及90类催化酶，参与多类物质代谢；在黄酒发酵中对纤维素降解发挥不可取代的重要作用，可能对乙醇和杂醇的生成、甘油三酯水解有贡献，能够将原料中功能物质阿魏酸水解释放，且有降解有害物质亚精胺为γ-氨基丁酸（GABA）的潜力。葡萄球菌属可能对氨基酸合成、杂醇生成、脂肪酸合成、甘油三酯水解、酯类生成和GABA降解的代谢途径参与度较高，而对淀粉和纤维素的降解、乙醇和杂醇的生成参与度较低。乳杆菌属和乳球菌属是黄酒发酵中的重要产酸菌，可能参与淀粉水解、氨基酸合成、GABA生成与降解、2，3-丁二醇合成、脂肪酸合成、原儿茶酸生成等。链霉菌属可能参与乙醇、2，3-丁二醇和杂醇的合成。拟无枝酸菌可能对2，3-丁二醇、脂肪酸和酯类合成的代谢途径参与度较高。多孢放线菌和笄霉属注释多种功能类别，但注释到完整的代谢途径较少，测序结果显示多孢放线菌有产GABA的可能性，笄霉属仅在黄酒后酵样本中检测到，且是唯一注释到苯丙氨酸转化为酪氨酸的催化酶的微生物属，可能参与杂醇的合成。

4.4.3.2　杂醇的微生物网络代谢途径

β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、3-甲硫基丙醇、2，3-丁二醇是黄酒中含量前五的醇类。β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、3-甲硫基丙醇均可由氨基酸通过分解代谢途径（Ehrlich途径）代谢生成。酪醇和色醇也可由氨基酸降解形成。据报道红酒中的酪醇是与心脏保护功能有关的物质，但在啤酒中酪醇和色醇是引起上头的诱因，目前酪醇和色醇在黄酒中的报道还寥寥无几。2，3-丁二醇是酒类中少有的呈香多元醇之一，其微生物合成途径以丙酮酸为前体。

（1）β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、3-甲硫基丙醇的生成途径

杂醇的生成有分解代谢途径（Ehrlich途径）和合成代谢途径（Harris途径）。分解代谢途径即氨基酸降解途径，α-酮酸来自氨基酸脱氨；合成代谢途径是以糖类物质合成杂醇，α-酮酸来自糖酵解产物丙酮酸的链增长反应，而后脱羧和还原形成相应的杂醇。2种途径的区别在于α-酮酸来源不同。在杂醇的生成途径中，关键催化酶包括转氨酶、脱羧酶和还原酶，其中部分催化酶也参与杂醇、乙醇和氨基酸等物质的代谢途径中，故此小节涉及的部分酶类与其他小节有所重复。

Ehrlich途径的转氨反应与氨基酸合成的最后一步为逆反应。支链氨基酸转氨酶（EC 2.6.1.42）、亮氨酸脱氢酶（L-leucine dehydrogenase，EC 1.4.1.9）可催化缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生成对应酮酸；缬氨酸-丙酮酸转氨酶（valine-pyruvate transaminase，EC 2.6.1.66）可催化缬氨酸与精氨酸之间的转氨反应；亮氨酸转氨酶（leucine transaminase，EC 2.6.1.6）可专一催化亮氨酸和谷氨酸间的转氨反应。样品中未注释到EC 1.4.1.9和EC 2.6.1.6，EC 2.6.1.42注释到4个细菌属和3个真菌属，均为黄酒发酵中的优势微生物，而EC 2.6.1.66仅注释到乳球菌属。苏氨酸脱氨酶（L-serine dehydratase，EC 4.3.1.19）可专一催化苏氨酸脱氨生成α-酮基丁酸，α-酮基丁酸可经链增长反应生成其他α-酮酸，EC 4.3.1.19注释到多孢放线菌、糖多孢菌属、链霉菌属、拟诺卡氏菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、曲霉属、酵母属、笄霉属。芳香族氨基酸氨基转氨酶Ⅰ（EC 2.6.1.57，EC 2.6.1.27，EC 2.6.1.5）注释到2个真菌属（曲霉属、酵母属），而芳香族氨基酸氨基转氨酶Ⅱ（EC 2.6.1.58，EC 2.6.1.28）仅注释到酵母属，显示了酵母属在芳香族氨基酸降解中的重要性。此外天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，EC 2.6.1.1）和组氨酸磷酸转氨酶（histidinol-phosphate aminotransferase，EC 2.6.1.9）、苯丙氨酸脱氢酶（L-phenylalanine dehydrogenase，EC 1.4.1.20）、氨基酸氧化酶（L-amino-acid oxidase，EC 1.4.3.2）也可催化苯丙氨酸和酪氨酸形成对应的酮酸，测序结果注释EC 2.6.1.1和EC 2.6.1.9，共注释到真菌4个属和细菌4个属。D-苯丙氨酸脱氢酶（D-amino-acid dehydrogenase，EC 1.4.5.1）和丙氨酸转氨酶（D-alanine transaminase，EC 2.6.1.21）可降解D-苯丙氨酸生成对应的酮酸，EC 1.4.5.1注释到地嗜皮菌属和糖多孢菌属，EC 2.6.1.21注释到葡萄球菌属，说明曲霉属、酵母属可能仅催化L-苯丙氨酸降解。

Ehrlich途径中α-酮酸脱羧反应为不可逆反应，α-酮酸来自氨基酸的脱氨或Hariss途径，脱羧反应催化酶包括丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase，EC 4.1.1.1）、脱羧酶（carboxylyases，EC 4.1.1.-）、苯丙酮酸脱羧酶（phenylpyruvate decarboxylase，EC 4.1.1.43）。样品中注释到具有广泛底物特异性的EC 4.1.1.1和EC 4.1.1.-，EC 4.1.1.1注释到匍柄霉属、曲霉属、酵母属和笄霉属4类真菌，EC 4.1.1.-注释到酵母属和葡萄球菌属、乳杆菌属、链霉菌属；未注释到可专一催化苯丙酮酸脱羧反应的EC 4.1.1.43。优势微生物糖多孢菌属注释到多种氨基酸的完整代谢途径，但在杂醇代谢中，糖多孢菌属没有注释到任何脱羧酶，表明糖多孢菌属不是黄酒中生成杂醇的关键微生物。

Ehrlich途径的最后一步是醛的还原反应，催化酶包括醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，EC 1.1.1.1，EC 1.1.1.2）、芳基醇脱氢酶（aryl-alcohol dehydrogenase，EC 1.1.1.90）、丙酮醛还原酶（NADPH-dependent methylglyoxal reductase，EC 1.1.1.283），其中EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2也参与乙醇的代谢途径。芳基醇脱氢酶（aryl-alcohol dehydrogenase，EC 1.1.1.90）催化苯乙醛还原成苯乙醇，注释到拟无枝酸菌和链霉菌属、乳杆菌属。EC 1.1.1.283的催化作用在异戊醇的生成中有报道，注释到酵母属。

Ehrlich途径中，转氨反应注释到的微生物最多，共13个属。根据注释信息发现链霉菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母属、笄霉属6个属参与完整的Ehrlich途径，其中曲霉属和酵母属参与芳香醇的完整Ehrlich途径。

（2）β-苯乙醇的非酮酸合成途径

β-苯乙醇的生物合成具有多条途径，注释到以苯乙胺或苯乙酸为中间产物的合成途径。

以苯乙胺为中间产物的合成途径中，L-苯丙氨酸脱羧生成苯乙胺，再经脱氨生成苯乙醛，而后还原为苯乙醇，此形成途径通常很少发生。此途径注释到3类酶，共注释细菌5个属和真菌1个属，曲霉属注释到完整途径，而与杂醇代谢相关的重要微生物酵母菌未注释到此途径。苯乙胺是一类具有生理活性的物质，微量的生物胺具有积极作用，过量的生物胺会引起不良反应。苯乙胺生成反应中，未注释到苯丙氨酸脱羧酶（phenylalanine decarboxylase，EC 4.1.1.53），仅曲霉属注释到芳香族氨基酸脱羧酶（aromatic-L-amino-acid decarboxylase，EC 4.1.1.28），说明黄酒中曲霉属是苯乙胺形成的关键微生物。拟无枝酸菌、Kutzneria、假诺卡氏菌属、糖多孢菌属、链霉菌属和曲霉属6个属注释脱氨反应催化酶，假诺卡氏菌属外的5个属注释到还原酶。

以苯乙酸为中间产物的途径中，L-苯丙氨酸经氧化、脱氨形成苯乙酸，最后还原形成苯乙醇。无微生物注释到此完整途径。氧化L-苯丙氨酸生成苯乙酰胺的催化酶catalase-peroxidase（EC 1.11.1.21）仅注释到糖多孢菌属，而有11个属注释到苯乙酰胺脱氨反应的酰胺酶（amidase，EC 3.5.1.4）。在苯乙酸和苯乙醛相互转化中，曲霉属、酵母属注释到醛脱氢酶{aldehyde dehydrogenase［NAD（P）+］，EC 1.2.1.5}，糖多孢菌属注释到催化苯乙醛氧化生成苯乙酸的苯乙醛脱氢酶（phenylacetaldehyde dehydrogenase，EC 1.2.1.39）。根据注释信息推测糖多孢菌属可能主要与苯乙酸的生成相关，曲霉属和酵母属参与苯乙酸的消耗。

（3）2，3-丁二醇的合成途径

2，3-丁二醇的微生物合成途径中，两分子的丙酮酸在乙酰乳酸合成酶（alpha-acetolactate synthetase，EC 2.2.1.6）催化下形成2-乙酰乳酸和2-乙酰-2-羟基丁酸［（S）-2-Aceto-2-hydroxybutanoate］。2-乙酰乳酸在2-乙酰乳酸脱羧酶（alpha-acetolactate decarboxylase，EC 4.1.1.5）催化下脱羧形成3-羟基丁酮（乙偶姻），或自然氧化脱羧形成双乙酰（丁二酮）后在双乙酰还原酶（diacetyl reductase，EC 1.1.1.303，EC 1.1.304）催化下不可逆还原形成3-羟基丁酮。最终在丁二醇脱氢酶（butanediol dehydrogenase，EC 1.1.1.4，EC 1.1.1.76）催化下2，3-丁二醇和3-羟基丁酮相互转化。双乙酰还原酶活性与丁二醇脱氢酶相关，丁二醇脱氢酶活性是可逆的，但是双乙酰还原酶活性是不可逆的。

黄酒样品测序结果中EC 4.1.1.5注释到葡萄球菌属和乳杆菌属，EC 1.1.1.303和EC 1.1.1.4注释到红球菌属、拟无枝酸菌、糖多孢菌属、链霉菌属、乳杆菌属、乳球菌属、马杜拉放线菌属、葡萄球菌属和酵母属，其中在酵母属、红球菌属、葡萄球菌属和乳球菌属有双乙酰还原酶和丁二醇脱氢酶的报道。厌氧条件下，2-乙酰乳酸在EC 4.1.1.5催化下脱羧形成3-羟基丁酮；而有氧条件下，2-乙酰乳酸自然氧化脱羧形成双乙酰，然后还原为3-羟基丁酮。而黄酒发酵过程中2，3-丁二醇主要在通气开耙次数较高的氧气充足的主酵期间（24h）积累，推测黄酒发酵中的3-羟基丁酮可能由2种途径形成。根据注释信息，发现拟无枝酸菌、糖多孢菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、乳球菌属和酵母属7个属参与丙酮酸合成2，3-丁二醇的完整途径。