第四节 游离分析物免疫检测

游离激素假说最初由Robbins和Rall在20世纪50年代末期提出。游离激素假说认为，有些激素在体内同时存在结合形式以及游离形式，但是仅游离激素决定着激素在体内的活性。甲状腺激素（甲状腺素，即T₄和3，3′5-三碘甲腺原氨酸，即T₃）和一些类固醇激素（如睾酮）广泛适用于这一假说。这一假说也适用于其他分析物，如维生素和药物，但受限于缺乏测量游离维生素和药物的准确方法，故鲜有证据表明此类分析物的游离态浓度而非其总浓度与之生物活性有更密切的关系。游离分析物（如游离甲状腺素，FT₄）测量方法的开发始于20世纪70年代，主要基于Ekins及其同事的开创性工作（如Ekins&Ellis，1975；Ekins等，1980）。在过去的20年中，大量的方法被开发出来，而其中许多方法最近已经实现自动化（例如，见第七部分第二节“甲状腺”或Demers，1999），这就增强了这类方法在临床实践中应用的吸引力。由于关于某些商业方法的准确性和有效性仍存在争论，因此目前欧洲大多数实验室测量的是FT₄而非总T₄（TT₄），而美国FT₄测量在甲状腺检测中所占的比例低于欧洲。

本节的主要目的是介绍血清中游离分析物浓度计算的基本机制，以及这些机制如何应用于开发有效的游离激素测定方法。此外，本节将描述可有效测量游离分析物的简单实验方法。

一、控制游离激素浓度的基本原理

某些激素（如甲状腺激素和类固醇激素）在内源性释放进入血液循环后与运输蛋白（transport proteins）结合。同样，一些药物和维生素在外源性给药后也会形成结合蛋白-分析物复合物，并保留一小部分药物或维生素处于非结合态。分析物与血清蛋白的结合是可逆的，在达到平衡状态时，分析物与血清蛋白的解离速率等于其结合速率。血清蛋白结合的分析物比例取决于每种结合蛋白的相对亲和力和蛋白质浓度。现在普遍认为（至少针对甲状腺激素和类固醇激素是如此）游离分析物，而非其与血清蛋白结合的部分，是与受体结合并发挥生物活性的部分。这并不意味着激素-结合蛋白复合物没有功能，复合物的主要作用是通过激素与蛋白质结合的平衡而保证器官组织激素的供应相对稳定。因此，当游离激素被组织吸收时，通过复合物的解离可获得足够的游离激素，以确保向组织提供近乎恒定的游离激素。激素-蛋白质复合物的这一特性（即激素与蛋白质的分离，同时保持接近恒定的游离激素浓度）已被用于开发测量游离激素浓度的方法。

由于游离甲状腺素（FT₄）是被研究最广泛的激素，因此在本节的其余部分中，FT₄被用作一个典型案例来说明游离分析物浓度计算和其测量方法开发中所涉及的原理。本节所讨论的原理适用于所有游离分析物的测量。

二、游离分析物浓度的计算

以T₄为例，随着T₄从甲状腺释放到血液循环中，它会与三种不同的蛋白质结合，包括甲状腺素结合球蛋白（TBG）、人血清白蛋白（HSA）和甲状腺素视黄质运载蛋白（transthyretin，TTR）。正常个体总甲状腺素和结合蛋白的典型浓度以及结合蛋白（与T₄）的平衡常数（K_eq）如下所示。

TT₄浓度=1×10-7mol/L；

TBG浓度=3.57×10-7mol/L，

K_eq=2.2×1010L/M；

HSA浓度=6.18×10-4mol/L，

K_eq=1.3×106L/M；

TTR浓度=5.56×10-6mol/L，

K_eq=3.9×107L/M。

T₄与蛋白质结合的比例取决于每种蛋白质的相对结合能力（relative binding capacity），即亲和力（K_eq或K）乘以浓度。因此，在平衡时，

游离T₄的浓度是由结合的T₄与蛋白质未结合位点之间的平衡所控制的。FT₄的浓度可以通过质量作用定律（law of mass action）计算。如下所示：

式中P_BT4代表蛋白质结合的T₄的浓度；K代表蛋白质针对T₄的净亲和力；［P_free］代表蛋白质上未结合位点的浓度。

基于上述方程、分析物总浓度以及结合蛋白和T₄间亲和力，可以很容易地预测体内血清FT₄浓度。在下文中，体内血清FT₄浓度计算中的相关数据被归纳为一张表格。该表格也可以扩展到免疫检测试剂（如抗体和其他化学物质）中，因此可以用来预测这些试剂在使用时对血清FT₄浓度的影响。

三、游离分析物浓度计算的电子表格

游离分析物的浓度可以通过电子表格计算得出。仍然以FT₄为例进行说明，相关程序可由作者提供。该程序能够被用于计算体内或体外（如通过免疫检测）的FT₄浓度。

表2-4-1显示了体外FT₄浓度的计算推导过程，表2-4-2以一组数据为例展示了计算的结果。体内FT₄浓度可以用相同程序进行计算，但需去除公式中试剂相关部分（即输入“0”作为试剂的浓度和体积）。

计算步骤简要概述如下：

在C列（单元格4～6）中输入血清、抗体和其他试剂的体积，在单元格C7中通过加和得到总反应体积。通过总反应体积除以血清体积（即C7/C4）可获得稀释系数。如果需要计算体内FT₄浓度，则在抗体体积（单元格C5）和其他试剂（单元格C6）中输入0。

（1）在C列（单元格C13～C16）中输入血清中结合蛋白（TBG、HSA和TTR）、TT₄的浓度以及免疫检测中使用的抗体的浓度（以g/L表示）。如果免疫检测试剂中引入其他结合蛋白（如牛血清白蛋白，BSA），则在C20中输入其浓度。

（2）在D列中，输入结合蛋白和TT₄的相对分子质量。

（3）在E列中，通过将C列输入的质量浓度除以D列的相对分子质量来计算结合蛋白的摩尔浓度。

（4）在F列中，计算出免疫检测“管”中结合蛋白和TT₄的摩尔浓度。

（5）在G列中，输入单个结合蛋白（包括模拟免疫检测性能相关程序中的抗体）的亲和常数。

（6）在H列中，通过G列乘以F列计算出亲和力（即K ［P_total］）。

（7）在单元格H25中，计算出H列总和。

（8）在I列中，通过将F列与H列/单元格H25的结果相乘获得每个蛋白结合的T₄的浓度。

（9）在单元格H26中，通过单元格F16（TT₄浓度）减去F16/H25得到总蛋白结合的T₄（PBT₄）浓度。

（10）在J列中，通过F列减去I列获得每种蛋白质上未结合位点的浓度。

（11）在K列中，通过G列与J列相乘，得出产品K ［P_free］。

（12）在单元格H27，计算K列之和。

（13）在单元格H28，通过H26除以H27，得出FT₄浓度。

（14）在L列中，通过H列除以H25可获得每个蛋白质携带的T₄比例。

（15）在M19单元格中，通过将J19除以F19可估算出未结合的抗体比例。

上述电子表格基于结合蛋白仅与一种底物（本例中为T₄）结合而进行计算，其可以扩展至其他底物同时竞争结合蛋白的情况（如T₃）。后面章节中的模拟计算仍然采用上述表格，在FT₄的例子中，T₃的贡献未对FT₄分析结果产生显著影响。然而，当血清中存在大量的结合抑制剂（如非酯化脂肪酸）时，采用上述计算表格将严重低估FT₄的浓度。此外，本程序假设T₄与相关结合蛋白之间已达到完全平衡，但这种情况在某些免疫检测方法中可能并非如此。因此，建议以定性角度（如确定激素浓度将上升或下降）对待上述计算结果。

可以通过输入相关亲和力和结合蛋白浓度（以及总分析物浓度）等数据构建为其他游离分析物（如FT₃、皮质醇、睾酮等）来构建类似的程序。然而需要注意的是，以FT₃为例，由于蛋白质对T₄的亲和力远强于T₃，计算FT₃浓度时T₄将具备显著贡献，因此需要构建一个更加复杂的计算程序。

四、血清蛋白质对游离分析物浓度的影响

与前文相同，游离甲状腺素仍然作为示例分析物。

使用电子表格程序，可以模拟预测任何情况下的FT₄浓度，如当某种结合蛋白质浓度和亲和力（K ［P_total］）发生变化或TT₄浓度改变时的情况。

图2-4-1显示了改变内源性蛋白质浓度（同时保持TT₄浓度恒定）对FT₄的影响。

在本例中，单个蛋白质（TBG、HSA和TTR）的浓度发生变化（从正常浓度的1/4变为正常浓度的4倍），而TT₄的浓度保持在100nmol/L（甲状腺功能正常浓度）。从图2-4-1中可以清楚地看出，蛋白质浓度的升高将导致FT₄浓度的降低，而蛋白质浓度的降低将导致FT₄浓度的升高。同时，图2-4-1也表明FT₄浓度主要受TBG浓度（亲和力）的影响（控制），而不是其他两种结合蛋白。这也是T₄/TBG比值被用于“间接”度量FT₄浓度的原因。

然而，由于T₄/TBG的计算使用的是总TBG浓度而非未结合位点的浓度，其结果与FT₄真实浓度仍然存在差异。图2-4-2展示了预测的FT₄浓度（使用电子表格程序）和FT₄“指数”的差异，相关数据通过向甲状腺功能亢进患者血清中添加不同浓度的T₄（并以“FT₄单位”校准）计算得出。

结果表明，T₄/TBG比值与TT₄浓度呈线性关系，而FT₄与TT₄浓度呈曲线关系。在高TT₄浓度（当TBG上的未占据结合位点浓度降低时）下，T₄/TBG比值出现负偏倚（与FT₄相比），而在低TT₄浓度（当TBG上的未占据结合位点浓度增加时）下，T₄/TBG呈正偏倚。这一情况在图2-4-3中也进行了说明（作为偏倚图）。可以预测，在TBG对T₄亲和力降低或血清中含有可与TBG结合的物质时（从而降低未占据位点浓度），也会得到有偏倚的T₄/TBG结果。如果不考虑结合位点的减少，电子表格程序估算出的FT₄浓度也将呈现上述规律。

电子表格的计算有助于理解在某些临床条件下可能影响FT₄浓度的机制。例如，重症患者的FT₄浓度通常比门诊患者的FT₄浓度高约30%，而这些重症患者中相应的TT₄浓度却比门诊患者低约50%。为了解释TT₄和FT₄之间的不一致性，一些假设被提出，其中包括：

● 患者血清中含有与白蛋白结合的物质，降低了未被占用的T₄结合位点的浓度；

● 白蛋白浓度降低；

● 白蛋白对T₄结合亲和力降低；

● TBG对T₄结合亲和力降低或TBG浓度降低。

利用电子表格中的公式，人们可以通过计算不同条件下FT₄的浓度来挑战上述假设，并确定TT₄/FT₄不一致的最有可能原因。结果表明，无论HSA和TTR的亲和力以及浓度降低到何种程度，低TT₄浓度（比正常浓度低50%）都不会引起FT₄浓度的升高。然而，如果TBG的浓度或者亲和力降低75%～80%（或当浓度和亲和力降低50%时），将导致FT₄浓度上升30%。由此可见，患病人群中FT₄/TT₄的比例特征很可能由于TBG的浓度或亲和力降低而形成。而事实上，上述两种可能性在非甲状腺疾病（non-thyroidal illness，NTI）患者中均有发生（Csako et al.，1989；Wilcox et al.，1994）。

五、游离分析物浓度的体外测量

有许多不同的方法可用于量化生物体液中的游离分析物浓度。所有的方法都涉及“取样”，即从血清样本中获取一些游离分析物，然后定量分析待测组分的含量。无论采用何种方法，取样均要求获取的游离组分能够反映出其在体内的游离分析物浓度。本小节将审视不同取样方法是否满足上述要求。

（一）直接平衡透析

直接平衡透析（equilibrium dialysis，ED）是许多研究者认为的一种测量游离激素的参考方法。图2-4-4解释了本方法的基本原理。

ED腔体由两个腔组成，两个腔之间用半透膜隔开。半透膜允许小分子自由地从一个腔扩散到另一个腔，但大分子（如蛋白质）无法透过。进行透析处理时，血清样本和缓冲液被分别放在两个腔中。在孵育过程中，T₄和其他小分子从一个腔扩散到另一个腔。达到平衡时（通常在16h），两个腔之间FT₄以及其他小分子的浓度相等。然而，如图2-4-4所示，尽管FT₄在两腔中浓度（每毫升）是相似的，但存在于缓冲液腔中的FT₄分子的数量比在血清腔中的分子数量要多得多。FT₄分子的数量取决于两个腔液体的体积比。例如，在图2-4-4中，200µL血清与2.4mL缓冲液平衡，因此缓冲液腔中FT₄分子的数量是血清腔的12倍。这种“额外”的FT₄来源于结合蛋白，即通常与血清蛋白结合的T₄解离并扩散到缓冲液腔。

FT₄测定时的一个关键要求是采样所获取的FT₄（或在ED中，从血清腔扩散至缓冲液腔中的T₄量）不会改变体内FT₄的真实浓度，即在缓冲液腔中测量的FT₄浓度应与其在未透析血清中的浓度保持一致。直接ED方法能否满足上述要求，取决于以下因素：

● 透析缓冲液的缓冲液组成和pH（其影响结合蛋白的亲和力）；

● 透析过程环境温度（蛋白质的亲和力与温度相关）；

● T₄非特异性结合（nonspecific binding，NSB）的强度（增加NSB会导致T₄进一步从结合蛋白上解离）；

● 膜的性质（即应该仅允许小分子透过）；

● 缓冲液体积与血清体积的比例。

这些因素是非常重要的，因为它们将决定从缓冲蛋白中解离出的T₄的浓度，从而决定待测的FT₄浓度。

最近一种基于直接ED和ID-MS的参考方法被提出（Thienpont et al.，2010），该方法被NCCLS批准的指南文件C-45A所推荐。

1.降低的蛋白结合的T₄浓度对FT₄浓度的影响

去除掉增量T₄后的FT₄浓度可以通过电子表格进行估算（图2-4-5）。当从甲状腺功能亢进血清中去除T₄的量逐渐增多时，血清中FT₄浓度逐渐降低。但是，FT₄浓度的大幅降低仅发生在非常大量地去除血清中T₄之后。例如，解离（去除）1 000pmol/L的TT₄仅会使FT₄浓度降低小于2%（或＜0.2pmol/L）。

2.血清稀释

上述例子考虑了FT₄从血清腔通过透析膜扩散至缓冲液腔的情况。在理想情况下，如果将血清用惰性缓冲液稀释也会观察到T₄与其结合蛋白解离并使FT₄浓度保持近似恒定。就机制而言，上述现象与透析的存在与否并无关系。图2-4-6展示了三种不同血清用相同一种惰性溶液（如 10mmol/L HEPES缓冲液，pH7.4）稀释后计算（使用电子表格程序）出的FT₄浓度。其中一份血清具备正常的T₄结合能力，另两份血清的T₄结合能力分别比正常血清高4倍和低4倍（结合能力由结合蛋白亲和力乘以结合蛋白的浓度得到）。结果表明，在正常血清和高结合能力血清中，仅当稀释倍数高于1 000时才会使FT₄浓度显著降低（超过10%）。然而，在低结合能力血清中，稀释窗口降低，因此比正常血清更易引起FT₄浓度的显著下降。这些数据表明，为了在低结合力血清中获得正确的FT₄浓度结果，检测中应用的稀释倍数应保持在最低水平（其同样适用于其他游离激素检测方法）。在检测中若进行高倍血清稀释将会使这些患者产生负偏倚结果。

（二）游离分析物免疫检测

在所有FT₄（以及其他游离分析物）的免疫检测中，无论采用何种检测形式，均具备许多通用步骤：血清稀释步骤；抗体添加步骤；对抗体上未结合位点进行定量分析。

但是，这些检测方法在形式（对抗体上未结合位点的定量分析方法）上，以及在使用检测试剂和方法时对T₄/蛋白质平衡进行扰动的水平上均存在显著差异。

在稀释血清中加入抗体时，将会发生如下一系列事件。当抗体与FT₄结合，更多的T₄从蛋白质-T₄复合物上解离而形成更多的FT₄。因此，T₄在血清蛋白质以及抗体间进行重新分配。这种重新分配取决于抗体的浓度、亲和力（相对于血清的结合能力），以及缓冲液配方中的其他成分（如BSA）是否会影响T₄与血清蛋白的结合。上述过程所涉及的反应能够用如下两个简单公式描述：

式（2-4-2）（前文已介绍）描述了体内FT₄的血清浓度：

式中PBT₄代表蛋白质结合的T₄浓度；K代表蛋白质（针对T₄）的净亲和力；［P_free］代表蛋白质上未结合（游离）的结合位点浓度。

式（2-4-3）描述了体外（即在免疫检测管中）FT₄的血清浓度：

式中PB_T4和IA_T4分别代表与血清蛋白和与免疫检测试剂（包括抗体）结合的T₄的浓度；K ［P_free］+K ［IA_free］代表血清蛋白质与免疫检测试剂的结合能力（即亲和力乘以未结合位点的浓度）。

电子表格程序能够用于计算体外（即免疫检测管中）和体内FT₄的浓度。它也能够用于分析：

● 添加抗体（具备不同K ［P］）对血清稀释FT₄的影响；

● 具备不同结合能力（K ［Ab］）的抗体对不同患者人群（即具有不同血清结合能力（K ［P_free］ ））的偏倚效应；

● 外源性结合物（例如，添加到免疫检测试剂中的不同数量的BSA）的偏倚效应（对FT₄）；

● 免疫分析中抗体的最佳亲和常数（K_eq）要求。

1.抗体添加对游离分析物样本稀释曲线的影响

当抗体亲和力（K）和抗体浓度（［P_ab］）从0（即未添加抗体）变化到K ［P_ab］为免疫检测管中总结合能力的0.2%、0.5%、1%和15%，即K ［P_ab］/（（K ［P_ab］）+K ［P_total］）比值为0.002、0.005、0.1和0.15时，血清稀释曲线的变化情况如图2-4-7所示。在这些情况下，抗体将截留（或“抽出”）血清总T₄的0.2%～15%。这些用于模拟的甲状腺功能正常的血清中结合蛋白和T₄的浓度与本小节前文假设相同，免疫检测中采用25µL血清样本，而检测反应终体积为125µL（试剂中仅抗体可与T₄结合）。血清的稀释系数为1（即血清在反应前后为5倍稀释，而在检测过程中未对血清进行额外稀释）至160。

结果表明，当抗体浓度以及亲和力（K ［P_ab］）的联合效应与天然结合蛋白的总浓度和亲和力相比维持在最低水平时，如K ［P_ab］ /（（K ［P_ab］） +K ［P_total］ ）比值小于0.5%时，FT₄浓度在血清稀释过程中保持相对稳定。当K ［P_ab］较高时，FT₄浓度随着稀释因子增大而降低；随着K ［P_ab］ 的增加，稀释导致的FT₄浓度下降逐渐增强。血清稀释曲线的临床意义将在本节后文中进行讨论。

2.抗体对不同患者群游离分析物浓度的影响

图2-4-8描述了血清中添加抗体（具备不同K ［P_ab］）时所造成的偏倚效应。图中抗体的结合能力覆盖了进行甲状腺功能测试的患者的常见情况（Nelson等人提示上述结合能力存在30倍差异，重症患者蛋白质结合能力比门诊患者低8倍，而妊娠血清或TBG过量患者比门诊患者血清结合能力高4倍）。其他血清T₄结合能力低下的人群包括TBG缺乏症患者、甲状腺功能亢进患者和患呼吸窘迫综合征的新生儿。

结果表明，使用高K ［P_ab］抗体时，低结合能力患者血清会产生负偏倚，而高结合能力患者血清会产生正偏倚。仅当抗体K ［P_ab］较低，如K ［P_ab］/（K ［P_ab］ +K ［P_total］ ）低于1%时，检测结果会接近FT₄的真实浓度，即小于10%差异。

3.免疫检测试剂中BSA对游离分析物浓度的影响

在大多数免疫检测试剂中通常会包含外源性蛋白（如BSA），用于减少抗体或分析物的NSB。在使用免疫法测定FT₄和FT₃时，试剂中引入BSA可以使检测对非酯化脂肪酸（NEFAs）*具有鲁棒性。图2-4-9模拟了免疫检测试剂中不同浓度外源性BSA在具备不同T₄结合能力血清中对FT₄浓度的影响。免疫检测中采用25µL血清样本，其最终反应体积为125µL。结果表明，在游离激素免疫检测试剂中引入BSA会对测量结果产生不同影响。当检测试剂中BSA浓度增加时，低结合能力血清的负偏倚会变大，而高结合能力血清则产生正偏倚。至于BSA会防止NEFA干扰的观点（NEFA会与BSA结合），由于接受肝素治疗的患者通常血清T₄结合能力较低，BSA实际上会导致FT₄浓度出现负偏倚。由于NEFA的产生使血清组成改变而导致FT₄体外浓度与体内浓度不同，因此不建议对接受肝素治疗的患者进行FT₄和FT₃水平的测定。

4.抗体亲和力和浓度的优化

截至目前，电子表格程序已被用于当分析物/蛋白质平衡受外源添加缓冲溶液（血清稀释）或分析物结合物（抗体和BSA）的影响而产生干扰时，或受结合蛋白浓度和亲和力变化影响时，预测游离分析物的浓度。这些模拟的结果表明，为了开发一种有效和准确的游离分析物检测方法，对于分析物/蛋白质平衡的干扰应降至最低。如果样本内在的精密平衡被破坏，游离分析物测量对比总分析物测量的优势将会丧失，因为此时游离分析物的检测结果将接近总分析物的结果。

前文中讨论可见，在血清中添加抗体会导致其FT₄浓度降低，降低的程度取决于抗体的结合能力（K ［P_antibody］）。因此，为了减少上述偏倚，抗体的结合能力需要被保持在较低水平。模拟计算显示，抗体的最佳结合能力应小于正常血清结合能力的1%。采用电子表格程序，可以改变抗体的亲和力和浓度，从而使K ［P］保持在正常血清结合能力的1%。如前所述，在这些情况下抗体将截留（或“抽去”）1%的血清TT₄。随着总T₄（表格中单元格C16）浓度改变，抗体上的未占据结合位点的百分比（单元格M19中的计算结果）与FT₄的浓度均会发生改变。图2-4-10展示了上述模拟计算的结果。显然，采用高亲和力（1×1011L/mol）抗体（浓度为1.79×10-10mol/L），会使FT₄检测具备优异的灵敏度，但其检测范围有限，因此并不适于常规应用。

随着抗体亲和力的降低（通过调整抗体浓度，并保持K ［P］不变），剂量-响应曲线变缓但检测范围增大。当亲和力低于1×1010L/M时，曲线将过于缓和而不适于常规应用。令人惊讶的是两个文献报道的FT₄检测采用亲和力低于1×1010L/M的抗T₄抗体但却具备所需特性的曲线（Christofides et al.，1992；Christofides & Sheehan，1995）。这在文献中引起了一些争论，如Ekins（1992，1998）指出，上述检测中抗体的亲和常数测定存在错误，仅当抗体亲和常数大于1×1011L/M时才会产生必要的曲线形状。下面的数据展示了亲和力低于1×1010L/M时，抗体如何应用于FT₄的检测。

第一个实验采用一种T₄抗体（K为8×109L/M，其采用称重制备的T₄标准品，并用缓冲液进行稀释，通过经典的Scatchard曲线分析获得）。检测基于反滴定形式（见下一小节）进行，具体如下：25µL等分的血清FT₄标准品（通过ED校准）被加入到包被了驴抗绵羊抗体微孔中。向微孔中加入100µL绵羊抗T₄抗体，在37℃下孵育15min。孵育完成后，将微孔进行清洗并加入100µL含T₃偶联辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的溶液（T₃-HRP的加入可以减少抗体-T₄的解离）。孵育时间选择0.25～6h。此后，继续清洗微孔并加入HRP底物。HRP发光通过光度计进行测量。上述反应的剂量-响应曲线如图2-4-11所示。正如Ekins所预测的结果（如 Ekins，1998），当检测接近平衡时（孵育6h），采用亲和力小于1×1010L/M的抗体形成的剂量-响应曲线过于平缓而难以实际应用。然而，当孵育时间缩短时，剂量-响应曲线斜率显著变陡，0.25h的孵育时间可以形成有效的斜率和测量范围。

第二个实验采用125I标记的抗T₄鼠单克隆抗体，其亲和常数为5×109L/M，检测采用“标记”抗体方法（参见本节“标记抗体方法”部分）。50µL FT₄血清校准品被加入到聚苯乙烯管中，之后加入100µL示踪抗体和100µL 含T₃的溶液，其中T₃与磁性纤维素微球连接形成分离悬浮液（separation suspension，SS）。SS的浓度从“纯”溶液变化至1 000倍稀释。聚苯乙烯管在37℃下孵育60min，之后放置于磁性底座上20min进行分离。管中上清液被去除，微球通过伽马计数器（NE1600）进行测量。图2-4-12展示出采用不同浓度SS的检测方法所形成的剂量-响应曲线（由SS上结合的总抗体与FT₄浓度相比作图）。数据也以%B/B_o与FT₄浓度相比进行作图（图2-4-13）。上述数据可见，采用高T₃纤维素时，曲线形状非常平缓，因此检测不利于实际应用。这一结果与FT₄抗体亲和力低于1×1010L/M时灵敏度过低的预测保持一致。但是，随着T₃纤维素浓度的降低，剂量-响应曲线（针对FT₄检测）具备所需特征。图2-4-13中不同检测的ED₅₀（减少50%结合抗体量所需的FT₄浓度）范围从＞100pmol/L（采用“纯”T₃纤维素溶液）至13pmol/L（采用1/1 000浓度T₃纤维素溶液）。

上述两个实验清晰地表明，如果检测达到（接近）平衡，那么理论预测（不可能采用亲和力低于1×1010L/M的抗体形成有效的FT₄检测）是正确的。然而，使用非平衡条件和/或优化检测中的反应物，如调整T₃纤维素（用于从游离抗体中分离结合的抗体）的浓度和亲和力，可以开发出具备必要灵敏度和检测范围的FT₄检测方法。

5.返滴定（两步）法测试游离分析物

在此方法中，血清与固相载体上固定的抗体进行反应。在首轮孵育中（应在37℃下进行），抗体与血清中的分析物结合。首轮孵育完成后，反应混合物被吸走去除，并对固定抗体进行清洗。抗体上未被占据的结合位点通过与标记分析物结合而实现定量，如图2-4-14所示。

通常分析物类似物的标记物更为常用，与内源性激素相比其与抗体的亲和力更低，因此更有利于减少测试过程中已结合的分析物从抗体上解离。已知量的示踪剂与抗体结合并对比游离分析物浓度可以绘制校准曲线，因此抗体上结合的示踪剂数量能够通过校准曲线被转化为浓度。校准品所对应的游离分析物的浓度则通常由直接ED方法得出。

6.标记类似物示踪剂方法

在该方法中，血清与抗体（通常固定在固相表面）和标记的分析物衍生物（标记的类似物示踪剂）同时孵育。在孵育过程中（37℃），类似物示踪剂与游离分析物共同竞争抗体上有限的结合位点。抗体上结合的示踪剂的数量与分析物的浓度成反比。在孵育完成时，抗体与剩余的反应物分离，并对结合的示踪剂进行定量（测量基于示踪剂标记特性进行，如125I、酶或荧光基团），其结果结合校准曲线即可转化为浓度信息。校准品中对应游离分析物的浓度通常采用直接ED方法作为参考方法得出，如图2-4-15所示。

该方法以及标记抗体方法的一个重要要求是分析物类似物对任何血清结合蛋白均没有亲和力。如果类似物对血清结合蛋白具有亲和力，那么最终得到的游离分析物浓度将与蛋白质的浓度相关。类似物与蛋白质的结合能够通过将类似物与大蛋白质进行预先偶联而消除（Georgiou &Christofidis，1996；Tsutsumi et al.，1987）。偶联将为类似物引入足够的空间位阻，从而阻止其与血清蛋白质的结合。

7.标记抗体方法

再次以游离甲状腺激素为例。甲状腺激素（如T₄或T₄-蛋白结合物）被固定在固相表面（如微孔表面）。血清样本以及标记的抗T₄抗体被加入固相，混合物在37℃下孵育。在孵育过程中，抗体在液相（包含内源性FT₄）和固相上进行分配。固相上结合的标记抗体数量（当液相反应物从固相上分离后估测）与血清中FT₄的数量成反比，并且可以通过已知FT₄浓度的血清（浓度通常通过ED获得）进行定量计算。

通过固定T₃或T₃偶联物以及标记的抗T₃抗体示踪剂可以开发FT₃检测方法。

该方法的一种变体（Christofides et al.，1992，1995，1999a，b）已成功地用于开发商品化FT₄免疫检测方法（图2-4-16）。该方法借助于标记的抗T₄抗体与固定化T₃-蛋白质偶联物之间的弱交叉反应性（＜1%）。弱交叉反应的T₂-蛋白质偶联物已被用于FT₃检测方法的开发。

使用这种“异源检测”方法有诸多优点。首先，与所有的异源检测相同，此类方法的剂量-响应曲线更加陡峭。其次，该方法还具备包括反应动力学更快、信号强度更高以及针对内源性抗甲状腺激素抗体的抗干扰能力更强等优点。值得注意的是，对固定化抗原具有极高亲和力的T₃自身抗体以高浓度存在时，会对检测产生干扰。这些检测类型均包含两项重要要求，即甲状腺结合蛋白应避免与固定化抗原间存在结合力（其通常通过将抗原与大分子连接而满足），并且与所有游离甲状腺激素检测一致，应尽可能降低对内源性T₄/蛋白质平衡的影响。

（三）有效性（准确度）测试

利用前文所述的质量作用定律模型，可以设计实验对任意游离分析物检测方法的性能与理论检测性能进行比较。本文针对一些可实操的实验进行介绍。

1.血清样本中添加结合蛋白

当加入蛋白质增多时，可以预见游离分析物浓度逐渐降低。以FT₄为例，在检测中不含任何干扰物质的情况下，可以预测加入TBG所导致的FT₄浓度降低的百分比将大于加入等浓度的TTR或HSA所导致的FT₄浓度降低比例。该实验的问题在于游离分析物浓度的降低不仅取决于加入蛋白的浓度以及亲和力，而且还取决于内源性蛋白的浓度和亲和力。因此，除非外源性蛋白和内源性蛋白的浓度以及亲和力是已知的，否则直接比较上述实验结果和理论结果是不可取的。尽管如此，该实验在确定检测过程中存在严重问题时是有用的。例如，如果检测中使用的示踪剂针对任意结合蛋白具有亲和性，那么在血清中加入这种蛋白将导致FT₄浓度的显著上升（或不变），而非预期的FT₄浓度降低。

2.血清样本中添加结合阻断剂

随着结合阻断剂的加入，可以预见游离分析物的浓度呈现剂量依赖性升高。可以用于甲状腺激素的阻断剂包括药物诸如呋塞米、酮洛芬、苯丁氮酮、甲芬那酸、二苯海因、丙磺舒、舒林酸、芬氯酸和水杨酸等，以及其他物质包括苯胺-萘磺酸和非酯化脂肪酸（如油酸）。在这种测试中，由于游离分析物的浓度增加不仅与添加物质的浓度以及亲和力有关，而且与内源性蛋白质的浓度和亲和力相关，所以其与上述蛋白质添加实验类似，可以用于定性分析而非定量分析。

3.稀释测试

血清稀释测试是一种可以应用于任何游离分析物检测的定量评价方法。如果检测方法有效，那么血清稀释后应产生近乎恒定的游离分析物结果；但是如果检测方法无效，那么所得到的游离分析物浓度与稀释之前比会降低。在甲状腺激素检测中，该方法被用于预测不同患者类别下的检测性能（Christofides et al.，1999a；Christofides et al，1999b）。在血清稀释时会产生一组样本，其血清结合能力会反映出患者接受甲状腺功能测试时的结合能力谱。例如，在接受甲状腺功能测试的患者中，甲状腺激素的结合能力存在20～30倍跨度的差异；妊娠晚期血清稀释至20～30倍时可以重现这种跨度的差异。在血清稀释后任何FT₄浓度的降低都表明该检测方法可能低估了T₄结合能力较低的患者体内的FT₄浓度，例如住院患者。血清稀释试验中常用的缓冲溶液为10mmol/L HEPES（N- ［2-羟乙基］ 哌嗪-N′- ［2-乙烷］磺酸），（其可以从Sigma获取，货号H7523），pH7.4。这种方法的一个潜在问题是，当血清稀释至20～30倍时，会使检测试剂中的蛋白质含量过度降低，进而引起显著的非特异性效应。因此，稀释倍数应控制在4～8倍（以反映严重的低蛋白血症），以确保检测试剂中包含足够的蛋白质从而避免非特异性干扰。稀释依赖性的FT₄浓度降低表明此检测方法将产生负偏倚结果，而该血清的T₄结合能力较低。

4.与参考方法进行对比

在该方法中，对比时所选择的患者人群构成至关重要。当患者人群中排除了具备高或低结合力的个体时，无效的游离分析物检测方法与参考方法之间也会得到良好的比对关系。因此，该方法评估时应选择包含重症患者血清、住院患者血清、妊娠血清（尤其是妊娠晚期血清）。更为重要的是，用于对照的参考方法本身应该被证明是一种有效的游离激素检测方法。

六、总结

在测量患者样本中的游离激素或药物时，需要尽可能减少对分析物与结合蛋白之间平衡的影响。在对检测方法进行评价时，应聚焦于其对上述平衡的影响而非检测方法自身的构建形式。基于公认的物理-化学原理（如ED）所构建的检测方法并不一定有效；相反，当一个检测方法无效时，也并不意味着该方法所依赖的基本构架原理无效。

七、参考文献和进一步阅读

（张轶　译，何建文　审）