第五节 定性免疫检测的特点和设计

与定量免疫检测给出浓度值不同，定性免疫检测通常直接给出“诊断”或分类结果，如抗体/抗原阴阳性判断，即定性免疫检测通常给出是或否的结论。与定量检测相比，人们对定性免疫检测的第一印象可能是其更加简单，也更容易使用。然而定性免疫检测需要对产生的信号进行解释，即给出是或否的结论，而不仅仅是给出浓度值，因此这类方法与临床诊断紧密相关。整体而言，定性检测方法在设计时需要更加严谨，同时要求使用者理解其应用局限性。例如，很多定性免疫检测设定了灰区，表示在这一区段内不能给出确定的诊断结果或者结果需要进一步确认。以献血筛查为例，初筛阳性结果需要采用第二种定性或定量试剂确认。对于定性免疫检测的阴性结果而言，其可以不进行进一步的确认，并提供有意义的临床信息，如可以确认妇女并未怀孕。如果没有临床解释的特殊要求，这种阴性结果通常不会进行复测。因此，了解用户的需求和客户对测试结果的解释是定性检测方法设计的基础。

定性免疫检测在免疫检测法发明后不久即已出现。然而，在早期定性免疫检测中，每轮测试都需要进行标准化（因为早期定性检测方法非常依赖于精确的试剂浓度和放射性同位素的衰退平衡），这限制了其使用价值和可靠性。通过测试质控品，可以对每轮检测中的临界值信号水平进行修订。随着临界非放射性的、稳健的免疫计量检测技术的引入，如ELISA、侧向层流免疫检测，定性检测得到迅速发展。很多早期定性检测是为了测量抗体的滴度，如针对乙型肝炎病毒相关抗体的检测，其对应的“定量”检测结果的报告单位在不同的检测方法间存在差异。对定性检测方法而言，上述滴度测量结果使其具备部分定量检测的优势。

定性检测被广泛应用于筛查，因此其测试通量非常重要。特别是对于血液中心而言，大量的献血筛查样本一般选用大型自动化仪器进行定性检测。另一方面，定性检测也是家庭用户的常用方法，如最为常见的家用验孕试纸。上述两种情况涵盖大量不同使用场景，因此定性检测也被全科医生、兽医、警察、环境专家和安全专家等临床检验领域以外的专业人士使用。

定性免疫检测可以分为两类，一类是确认分析物是否存在，如病毒的抗原、抗体或毒品；另一类是区分分析物的浓度与背景浓度的差异，如验孕检测中的hCG测试。对于第一类检测，检测方法的灵敏度和特异性是关键因素；对于第二类检测，设计者还需要考虑到分析物在正常人群中的浓度分布。

在增长潜力方面，由于发展中国家市场的开拓和血筛查检测应用的拓展，定性免疫检测的市场规模正在稳定增长。

定性检测方法的开发在原理设计、条件优化、性能验证和确认中具备独特的特征，也受到额外的监管。本节所讨论的定性检测试剂的设计和开发的相关概念主要基于自动化的免疫检测方法，但其原则在其他类型的定性检测中同样适用。

一、定性检测的特点

（一）定义

免疫检测可以按照输出的结果分为定性、半定量和定量。定性指的是确定结果的性质或特征，而不是数量或量值。定性免疫检测（qualitative immunoassay）基于分析物是否存在或分析物浓度相对于已建立的参考点的高低，来区分两个或多个相互排斥的特征并得出相应的结论。在一些应用中，一个定性免疫检测方法可能需要同时检测两种或更多种分析物。定性检测的结果通常是二元的，即有反应性或无反应性。根据检测的设计，上述结果可以被解释为阳性或阴性。定量（quantitative）或半定量检测能推算出分析物的浓度。定性免疫检测不仅仅是简单地根据测量的浓度和参考区间来解释定性结果，更重要的是给出样本状态（如阳性或阴性）的结论。尽管部分定性检测与定量检测在某些领域或使用场景下存在一定重叠，但定性检测的首要目的不是确认样本中分析物浓度。

在定性检测中，通常定义分析物的某个阈值浓度水平（临界值，将在下面讨论）以判断分析物是否存在。分析物存在与否不应依据其浓度是否为零的绝对度量进行判断，而应该依据预先确定的基于检测灵敏度和特异性之间平衡的临界值进行判断，并与参比系统或临床结果进行比较。由于上述原因，定性检测的临界值附近通常存在灰区。

半定量检测（semiquantitative assays）基于定量检测结果的有临床意义的变化给出分类结果，通常认为其与定性检测十分类似。整体而言，半定量检测提供分类信息，如阴性、弱阳性、中等阳性和强阳性。半定量检测给出的分类结果与检测的应用相关。例如，监测患者对抗病毒治疗的应答时，可以测量患者体内抗病毒抗体的水平。换言之，半定量是指根据抗原浓度或抗体滴度的增加或减少提供额外的定性信息的能力，即定性结果的变化。与其他免疫检测方法类似，半定量检测的结果也有一定不确定性。在实际应用中，半定量检测与定性和定量检测之间均存在一定程度的重叠。从监管的角度来看，半定量检测法必须作为定性检测方法进行确认，才可以声称其分类结果具有临床意义。

在一些定量检测中，源自多个校准点的校准曲线可以将仪器的信号响应转换成数值单位，以确定样本中的分析物的水平。根据特定检测的临床应用需求，半定量免疫检测也可以提供丰富的定量信息。

定性免疫检测法可以通过设计达到尽可能高的灵敏度，这是其实际应用中的主要优势之一。这样，当样本中抗原浓度或抗体滴度非常低时，就可以报告阳性或反应性结果。在设计定性检测方法时，通常不需要对目标分析物形成可量化的或数字化的响应。

（二）抗原和抗体检测

定性免疫检测可用于检测抗原或抗体，或同时检测两者。然而，检测抗原和抗体的检测方法，其设计的目标和要求是完全不同的。如果检测抗原，如病毒抗原，检测方法必须以实现最大灵敏度为目标进行设计。这主要是为了在特异性不受过度影响前提下，在基质低背景中检出痕量的外源病毒抗原。然而，对于抗体检测，检测方法的设计虽然仍集中于实现最佳灵敏度，但需与更好的临床特异性达到平衡。此外，与抗原检测不同，抗体检测可以通过测量特异性抗体与特异性抗原结合的亲合力来获取抗体的滴度，而其结果通常以任意单位（arbitraty unit，AU）表示。

在设计检测方法以实现高灵敏度或特异性时，需要着重考虑假阳性和假阴性结果的临床影响。高灵敏度的实现通常以牺牲特异性为代价（反之亦然），因此必须要考虑到后续的确认试验，以达到检测灵敏度和特异性的平衡，并获得最佳的分析和临床性能。当检测方法的灵敏度过高时，其特异性可能相对较低，导致假阳性结果。例如，用于诊断时，高灵敏度的HBsAg检测将可能报告更多的初始反应性（阳性）结果，这些结果需要通过复杂流程以确认或纠正。此外，假阳性结果将导致不必要的重复测试，或者在血液筛查中导致不必要的结果延迟和有价值的血液制品的浪费。另一方面，在误诊的情况下，如抗HTLV抗体假阳性，特别是考虑到与该病毒相关疾病发病率相对较低，患者可能承受过度的压力和恐慌情绪。与之类似，在癌症的诊断中，检测方法需要具备高特异性以使结果假阳性率最小化，防止由于治疗导致的医源性疾病。

对病毒IgM检测来说，检测的目的是替代传统病毒分离方法，快速诊断急性或原发性感染，因此必须证明该方法能够检测出病毒感染的真实疾病状态，并且不会漏检可能的阳性样本。病毒IgM检测试剂在设计时需要针对高特异性和灵敏度进行充分的优化。从这些例子中可以看出，在优化筛查试剂时，其后续确认试验相关的成本和风险不可忽视。

最后，需要注意设计针对正常人群（如献血者）的筛查检测和设计针对具有症状或临床病史的患者的诊断检测之间存在差异。

最新的第四代定性免疫检测能够同时检测抗原和抗体。检测方法的设计主要聚焦于实现最高灵敏度，如第四代HIV检测即可对早期血清转化期间产生的低水平抗体及HIV p24（gag）病毒抗原进行联合检测。在这些检测中，初筛阳性结果必须使用另外的试剂进行补充测试以确认HIV感染，因此检测方法具备合适的特异性仍然十分重要。HIV抗体是HIV感染的可靠指标，但其在约3～4周的初始窗口期后（并且某些个体的窗口期较长）才出现。HIV抗原抗体联合检测使之相对于NAT筛查的窗口期显著减少至2.35～4.04天。由于HIV基因组中免疫支配区域内的抗原变异性高，在设计检测方法时，需要优先选用多种从不同病毒株分离出来的、表达保守区域蛋白序列的抗原。对于美国和欧盟的监管当局来说，第四代检测方法如HIV抗原抗体联合检测越来越受欢迎，但其更为复杂，使开发和生产面临更多挑战。

（三）开发和监管要求

与定量检测类似，定性检测方法的主要开发过程通常包括可行性研究、优化、验证和确认以及产品发布。其中，验证和确认阶段对于开发定性检测方法非常关键。相比定量检测，定性检测确认的要求和方法与具体检测试剂关系更大，如临界值的验证和确认，以及不同类别和疾病阶段的检测灵敏度的确定。关于定性检测开发的更多细节将在后文进行介绍。

理解针对特定分析物和检测方法的监管要求同样重要。例如，在美国用于血液筛查的试剂由美国食品和药品管理局（FDA）的生物制剂部门监管，兽用筛查试剂由美国农业部（USDA）监管。监管机构高度关注定性检测的安全性和有效性，对于检测抗病毒IgM抗体的试剂尤其如此。实验室可能依赖于IgM检测来诊断病毒感染，因此相关IgM检测必须具备高特异性。如果IgM检测不能有效区分所检测的特定群体的真阳性和假阳性，则可能对受试者造成不利后果，如使健康个体接受不必要的抗病毒治疗。同样，假阴性结果可能导致治疗延误。此外，某些病毒感染的漏诊或误诊可能对孕妇和胎儿产生严重的不良影响。因此，相关机构对抗病毒IgM抗体检测的开发有一些特殊的要求。以下是定性抗体-抗原检测的监管要点，其原则也适用于特定IgM的检测。

● 抗原。分析物是什么抗原？为什么选择这种抗原？抗原是天然的还是重组的？它是蛋白质还是多肽？它是纯化的蛋白质还是细胞裂解液？在检测设计中使用的病毒株、抗血清和合成材料的来源是什么？所有这些都是决定检测的特异性和灵敏度的关键因素。

● 临界值。如何确定和验证临界值？必须基于受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线来建立。

● 质量控制（quality control，QC）材料。QC的关键要求是其材料应与检测的预期用途和临床效用相关，并具有代表性。定性免疫检测至少应该提供或推荐与测试样本基质相同的两个质控品（阳性和阴性）。

根据FDA的要求，如果是半定量检测，应进行适当的研究以证实结果与感染阶段（如早期、急性、感染减弱）的关系。感染阶段的判断应依据已确立的参考范围。对于每个感染阶段，应至少选择10名患者的结果以建立参考范围。如果厂家宣称检测具备半定量能力，还必须证明产品的线性达到或超过宣称的指标。

（四）临床应用

整体而言，定性检测适用于以筛查、诊断和确认为目的的检测场景。根据其应用对象的差异，不同的定性检测具有不同的特征。在筛查中，定性检测方法需要实现尽可能高的灵敏度，以使假阴性结果的风险最小化。然而，如前文所述，达到极高的灵敏度可能会牺牲特异性。因此，筛查试剂可能产生假阳性结果。对于以筛查为目的的定性检测，假阳性结果的危害远小于假阴性结果的危害。例如，在使用HBsAg试剂筛查献血者时，由于假阴性结果会给血液供应带来风险，因此高灵敏度非常重要，同时这也是监管的要求。相反，血液筛查中的假阳性结果对血液供应几乎没有风险。此外，虽然确认某些分析物的存在可能比较烦琐、耗时和昂贵，如果有必要也可以通过后续的确认实验来纠正假阳性结果，但是如果筛查时假阳性结果过多，可能需要大量的确认试验，并可能缩短血液制品保质期并导致献血者的流失，这可能会严重影响血库运行。同时，这些定性检测方法通常还可能用于诊断用途。因此，在设计过程中有必要尽可能减少假阳性结果的出现。

在用于诊断时，定性检测需要同时实现高灵敏度和高特异性。设计用于诊断的免疫检测方法的核心是在灵敏度和特异性之间实现最佳平衡。一些检测方法在设计中不仅确定样本的反应性和非反应性，而且预先设定了灰区或可疑区间。灰区或可疑区间根据检测的临界临界值确定，通常在关键的最小灵敏度附近。当检测出现可疑结果时，通常需要复测。

在一些应用中，定性筛查测试结果为有反应性的样品，随后会用合适的确认方法进行分析。对定性检测结果进行确认以保证其可靠性和准确性是重要的，而且在某些情况下是必需的。在作为确认方法时，定性检测需要具备高特异性和高阳性预测值。确认试验的检测方法在设计时，一般可以通过在首轮筛查检测中添加特定的中和抗体来确定特定分析物的存在与否，如在初筛阳性的样本中加入抗HBs抗体以确认HBsAg的存在。此外，一些筛查结果可以通过蛋白质印迹（Western blotting）或免疫印迹（immunoblotting）等其他方法确认，如对HCV和HIV的抗体初筛阳性结果的可以通过上述方法进行确认。确认试验的可能结果包括确认（阳性）、未确认（阴性）或不确定（可疑）。

在图2-5-1的判定流程中，Access HBsAg检测的临界值是1.0 S/CO（其中样品信号与临界值的比等于1），S/CO在0.9～1.0之间为灰区。当样本进行筛查测试时，如果结果≥1.0S/CO，则称为初筛阳性（initially reactive，IR）；如果结果在0.9～1.0 S/CO范围内，则称之为灰区（不确定（indefinite）或可疑（equivocal））。具有反应性或不确定结果的样品需要用筛查试剂复测两次。如果在总共三次筛查检测中有两次结果≥1.0 S/CO，则称为复测反应性（repeatedly reactive，RR）。具有RR结果的样本用确认试剂再次测试。如果确认对照的结果≥1.0 S/CO且中和率≥40%，则样品的结果被称为确认阳性（confirmed positive）。然而，如果确认结果的对照≥1.0 S/CO，而中和率＜40%，则需要进一步稀释后复测样本。如果确认结果的对照最终是＜1.0 S/CO，则称其未确认反应性（not confirmed reactive）。

确认初筛阳性反应结果的流程较为耗时。在采用定性检测方法进行诊断时，每个IR结果都应通过上述判定流程，以确认上述例子中最终结果是否为HBsAg阳性。因此，需要充分优化筛查检测方法以获得最佳灵敏度和特异性，从而尽可能降低初筛假阳性率。

在每种应用中，必须进行适当的临床研究，以表明其结果对疾病的判断与参比方法或“金标准”（如果存在）相一致。

二、定性检测方法的设计和开发

（一）检测模式的选择

定性检测使用的反应模式与定量检测相同，反应模式的选择主要取决于检测的预期用途和需求，如用于抗原或抗体的检测，以及患者、用户和监管机构的要求等。在进行定性检测设计时，必须精心选择合适的反应模式以满足设计输入。针对定性检测的特点，其设计时常见考虑因素如下：

1.对于抗原检测，最常用的模式是使用双抗体夹心法免疫检测。这种模式具有更宽的检测范围和更稳定的结果。对于小分子，如类固醇激素和药物等，最为常用的检测模式为竞争法。这种模式也可以用于抗原或抗体检测。

2.对于抗体检测，可以选择间接法、免疫捕获法或双抗原夹心法。

● 间接法（indirect format）：第一步，使用包被有合成蛋白质或多肽、纯化的病毒抗原或病毒感染的细胞裂解物的固相载体（如顺磁性颗粒）来捕获特异性抗体（IgG、IgM或总抗体）。第二步，使用酶或荧光标记的抗人IgG或抗人IgM检测捕获的抗体，或用抗原与标记的抗人IgG或IgM形成的免疫复合物检测捕获的抗体。

● 免疫捕获法（immunocapture format）：第一步，使用包被有抗人抗体（如小鼠抗人IgG、山羊抗人IgM或蛋白G/A）的固相载体捕获特异性人抗体（IgG、IgM或总抗体）。第二步，将捕获的抗体通过标记有酶或荧光基团的特异性抗原，或抗原与标记的抗人IgG或IgM形成的免疫复合物进行检测。

● 夹心法（sandwich format）：使用包被特异性抗原的固相载体也可以捕获特异性抗体，被捕获的抗体可以通过标记的特异性抗原检测。然而，这种模式下，需要了解抗原的性质并使用纯化的抗原，而且抗原需要具备合适的相对分子质量。双抗原夹心法不能区分IgG和IgM，其针对总抗体进行检测。

在检测抗体时，每种模式都各有利弊。一般而言，检测模式的选择需要综合考虑检测的对象为IgG、IgM、IgA或是总抗体，获取特异性抗原的可行性，不同亚类免疫球蛋白与特定抗原结合的竞争性，对干扰的敏感性等。以IgM检测为例，检测的灵敏度可能受非IgM免疫球蛋白影响。因此在免疫捕获模式中，捕获的IgM在第一步中与其他血清组分分离，防止后续IgM与IgG以及其他免疫球蛋白亚类间的竞争。对于间接法而言，其进行IgM检测时，灵敏度可能受到非IgM类免疫球蛋白的影响。然而，捕获法中特异性IgM也可能与其他非特异性IgM分子竞争固相载体上的抗人IgM抗体。因此，捕获法中灵敏度受特异性IgM抗体与总IgM的比例的影响。与间接法相比，免疫捕获法的缺点是需要针对每种待测的特异性IgM标记抗血清或抗原，即通常需要纯化的特异性抗原或抗原-抗体免疫复合物。 此外，标记抗原在实践中比标记免疫球蛋白更困难。

对特异性抗病毒IgM进行检测时，间接法易受类风湿因子（rheumatoid factors，RFs）的干扰。RF是识别人IgG的自身免疫抗体，通常属于IgM类。因此，间接法的第一步反应中，RF可以与被特异性病毒抗原捕获的特异性IgG结合。然后，标记的抗人IgM偶联物在下一步中可能识别结合的RF。当样本含有高滴度的特异性病毒IgG时，这个问题尤为突出。在这种情况下，特异性病毒IgG可以与特异性病毒IgM竞争结合固相上的抗原，进而影响测定灵敏度。另一方面，与间接法相比，免疫捕获法不易受到RF干扰。如果使用间接法，需要对样本进行前处理以去除IgG，从而改善测试含有高滴度特异性病毒IgG的样本时结果的可靠性。

（二）试剂的选择和优化

与定量检测类似，试剂优化对于设计定性检测方法而言也是至关重要的。其中，选择合适的生物活性原料（如抗体对和抗原），优化试剂配方，以及优化检测过程，都是试剂优化的重要要素。试剂优化可以从评估关键的影响因素开始，包括可能的浓度范围、可能的交叉反应物和其他干扰物质。将试剂性能优化提升到一个新水平，需要考虑如下关键因素：

1.抗体对：在检测设计的两端，即作为捕获或者检测，都使用单克隆抗体，以避免HAMA干扰。

2.抗原：天然的或重组抗原，在检测设计的两端，即作为捕获或者检测，使用的原料需要来自不同种属或使用不同的表达和细胞培养系统。

3.可以检出亚型或基因型。

4.固相化学：文献中有多种选择。

5.偶联化学：文献中有多种选择。

6.温育时间：满足灵敏度和特异性要求，以及满足用户需求。

7.检测模式：满足灵敏度和特异性要求，以及满足用户需求。

8.试剂的组成和浓度：阻断剂、稳定剂、防腐剂，以及化学品对环境的影响。

9.试剂稳定性：包括试剂在2～8℃下储存时的稳定性，用户可能经常将其移至环境温度以进行测试时的稳定性，以及从厂家运输到最终用户的过程中的稳定性。

10.用于制作校准品和质控品的抗原/抗体：重组的或天然的。

11.校准品和质控品的基质：样品的正确采集和处理。

12.样本类型：EDTA、肝素、柠檬酸血浆和血清的等效性。

检测方法的开发人员应评估这些因素及其相互作用对检测的准确性、精密度、重复性、灵敏度和特异性的影响。对定性检测而言，设置正确的临界值是最基本的要求。

（三）ROC曲线、临界值的确定和灰区

定性检测设计中最重要的参数之一是确定临界值。临界值是用于区分反应性和非反应性状态的信号响应水平，合理设定临界值是给出正确临床解释的先决条件。确定临界值的方法有很多种。通常，将临界值定义为阴性质控品平均值加上2～3倍SD。确定临界值的最佳方法为使用ROC曲线（ROC curve）临界。ROC曲线是用诊断测试的灵敏度对所有可能的假阳性率（1-临床特异性）作图。ROC曲线作为表征临床灵敏度（当疾病确实存在时检测出疾病）和临床特异性（当没有疾病时识别出没有疾病）的标准方法已被广泛认可（Obuchowski et al，2004）。ROC曲线体现了免疫检测设计时对临床灵敏度和特异性之间的权衡。通过对设计输入中灵敏度和特异性要求进行平衡，可以确定用于定性检测的最佳临界值（图2-5-2）。

选择ROC曲线设定临界值时，原则上是为了实现最少的假阳性和假阴性结果，以达到灵敏度和特异性之间的最佳平衡。假阳性结果或假阴性结果的危害和严重程度取决于检测的预期用途。

例如，用于献血筛查的检测方法应该具备高灵敏度，因为假阴性结果将对输血安全性产生极高的风险。相反，用于辅助诊断恶性肿瘤的免疫检测应该具有高特异性，因为假阳性结果可能导致不必要的治疗而给患者带来更高的风险。最佳临界“cutoff”值的确定对于每种用途是独特的；或者从更小的范围讲，对每种检测设计是独特的。因此，定性检测的“准确性”通常通过证明临界值能够给出满足诊断要求的灵敏度和特异性，从而在筛查的目标人群中达到最佳预测值来进行确认。

在实践中，由于生物和系统因素，没有一种检测具有完美的灵敏度和特异性。在某些情况下，设置临界值的目的是尽可能多的识别出真阳性，并尽量减少相同群体中的假阴性结果。在其他情况下，临界值的设定应以实现结果的真阴性结果的概率达到最大，而假阳性结果概率最小为目标。

综上所述，在待测生物标志物固有生物学特性的约束下，需要综合考量试剂选择、优化并合理设置临界值，以达到临床有效性的目标临界。

在检测方法设计时，需要定义和计算临界值，计算临界值的相关公式可以基于校准品建立（Xu et al.，1997）。例如，使用两水平校准时，其中一个校准品不含特定分析物用于反映系统的噪声信号，另一个校准品以基于功能灵敏度的浓度制备。临界值可以通过以下公式计算：

式中x、y和z是根据ROC曲线为获得最佳灵敏度和特异性所确定的参数。通常将定性检测的结果报告为样品信号与临界值（S/CO）的比值。定义反应性结果对应的S/CO后，要通过内部和外部研究进行确认。在大多数情况下，S/CO≥1.0意味着反应性或阳性。

在检测方法开发过程中，正常人群（没有症状的健康个体）中分析物的浓度水平通过采用临界值对一定数量的标本进行判断来确定。标本的数量应有统计学意义，标本来源的人群应符合预期临床用途，并应包含相关的样本类型。

尽管定性检测中临界值可能存在不确定性，但是临界值对分析和/或诊断的可靠性依然是方法确认过程中最重要的内容（Coste et al.，2006）。灰区（gray zone）是在定性检测中临界值的附近的一个区间；在此区间内，检测结果难以被归为反应性或非反应性，即检测结果可能为“不确定、可疑或无结论”。灰区的上限为诊断结果可以判断阳性，且阳性可能性最低的值。灰区的下限为诊断结果可以排除阳性，且阴性可能性最高的值。如果检测结果“非黑即白”，则可能由于检测系统和临床应用过程中的不精密性而造成偏差，不利于实际使用；灰区的设定避免了上述“非黑即白”的情形。灰区和临界值均应基于统计学上足够大的样本数量来确定，同时样本群中患病和未患病的个体必须能够代表常规测试的人群。对检测进行优化和确认的主要目的是确保灰区的范围尽可能窄，因此设计定性检测的理想目标是没有灰区。

在实际使用中，同一种检测方法针对不同人群或不同应用，可能设置不同的临界值。

（四）校准和质量控制

与定量检测中使用多个校准品浓度绘制校准曲线不同，定性检测通常使用双水平校准品来确定临界值。在某些情况下，如对于微孔板EIA而言，临界值通过重复测定校准品获得平均值并结合一个预先设定的值（方法确认过程中通过大样本量测试而来）计算而得。用于抗原检测的定性分析方法中的校准品，一般通过向合成基质中添加抗原而制备，以降低非特异性结合并实现更好的稳定性；用于检测抗体的定性分析方法中的校准品，则一般通过向血清或血浆来源的天然基质中添加抗体而制备。阴性校准品（校准品0，通常是基质本身）用于反映系统间差异，通常包含在临界值的计算公式中。第二个校准品（校准品1）中的抗原浓度或抗体滴度通常处于非常低的水平。如前文所述，临界值通常是校准品0和校准品1的函数，此函数通过测试大量阴性样品和弱阳性样品并形成ROC曲线来确定。同时，为了包容仪器台间差、检测日间差以及试剂批间差，临界值应进行微调。由于临界值主要由校准品1的信号响应值确定，因此校准品1的稳定性对于试剂的可制造性和结果重复性至关重要。

质量控制的目的是在检测试剂制造过程中监控产品性能并评估产品质量。对定性检测而言，质量控制没有统一的理论（Simonet，2005）。整体而言，质控品应该在成分和性质上类似于临床样本，以发现试剂的性能异常，如检测灵敏度的下降（Garrett，1994）。因此，理想的质控品应使用天然的基质、抗原和抗体进行制备。临床实验室改进法（Clinical Laboratory Improvement Act，1988）要求实验室使用与用于计算临界值的校准品不同的阳性质控。此外，除了试剂盒中制造商提供的质控品外，一些实验室还要求使用额外的阳性质控品。QC质控品至少应具备两个水平，即阴性和阳性质控，并与测试样本的基质相同。

根据检测方法原理和获取阳性样本的难易程度，可以通过混合和添加阳性人群样本的方式制备质控品。

（五）抗病毒抗体和亲合力测试

众所周知，在免疫后，由于抗体从IgM逐渐转换为IgG，因此抗体的亲和力随时间逐渐增强。亲合力测试的目的是测量目标IgG与包被在固相载体上的抗原的结合强度。抗体亲合力测试可以用于确认定性筛查的结果，以确定是否是近期感染。此外，抗体亲合力也可以通过定性检测来确定。用于抗体亲合力测定的定性检测的设计与常规的定性检测有些差异，其通常需要增加一个变性的步骤，来表征抗体结合能力的变化。

亲合力（avidity）是通过比较变性剂存在和不存在的情况下抗体结合亲和力的差异来测定的。高亲和力抗体的滴度测定通常需加入离液序列高的表面活性剂，如尿素、SDS、二乙胺或乙醇胺，以去除低亲合力IgG。表面活性剂可以预先加入患者样本或用于固相载体清洗，以缓解低亲和力抗体与固相的结合或温育过程中抗体与固相的结合。之后，通过加入相同的抗人IgG偶联物，可以得到结合的高亲和力IgG滴度。总IgG滴度测定时，通常选择上述相同的检测试剂，但无须添加上述表面活性剂。

亲合力指数可以通过存在和不存在变性剂的情况下的亲合力结果进行计算，公式如下：

通常，50%或更低的亲合力指数被称为低亲合力指数。

亲合力检测的方法确认，应当采用包含大量样本的、充分表征的样本盘；最终结果会确定亲合力临界值，高于临界值的结果误判风险低。

免疫应答的成熟过程因个体而异，因此应谨慎地解释抗体亲合力的检测结果。对于免疫功能低下或服用药物（包括一些抗生素）的个体尤其如此，其在弓形虫或CMV感染后可表现出亲合力增强趋势逐渐减缓的现象（Lefevre-Pettazzoni et al.，2006，2007）。

（六）验证和确认

毫无疑问，定性分析方法应该进行验证和确认（Taverniers et al.，2004）。目前定性检测方法众多，但用于评估二元性“是/否”响应和相关的定性检测的系统化方法鲜有报道（Trullols et al.，2005）。在实践中，验证和确认策略取决于相关定性检测方法的使用和设计过程中的具体特点。在验证和确认之前以及过程中，应当确定不同定性方法中最重要的质量参数。总的来说，定性检测的主要分析特性与定量检测类似，因此两者验证和确认的要求和规范也是相似的。然而，定性检测具备一些独特的特征。

（1）需要对定性检测方法中的临界值进行确认，以确保其满足分析和临床性能要求。临界值直接决定了阴性和阳性响应的范围，对于定性检测方法至关重要。结果不确定区域的上下限取决于临界值附近的测量误差。在确认过程中，样本的结果应该通过样本信号响应与临界值的关系来确定。通常，推荐测试中包含阴性、临界值附近或阳性的质控品。相关质控品可以通过将抗体人为添加到基质中，以达到目标滴度的方法来制备。在这个过程中，样本选择、临床决定水平和临界值附近区域十分重要。在临床应用时，临界值会决定诊断的结果，因此在方法确认过程中，诊断特异性和灵敏度是主要关注点。

对于定性检测而言，只有在高于检测限的浓度时才能获得定性结果。在确认临界值时，应提供相关数据以证实其可以有效区分阳性和阴性样本。确认过程中选择的样本，应包含与方法预期用途和建议的临床应用中相对应的相关疾病人群，且样本数量应具备统计学意义。此外，一项完整的临床确认还应考虑不同地域人群的差异。

为了对灰区进行确认，需要准备与临界值处分析物浓度相近的样本，包括浓度为临界值，浓度比临界值高20%和低20%；其样本量应足以进行20次重复测试。将每个样本重复测试20次，计算结果为阴性和阳性的百分比，然后通过分析-20%到+20%的浓度范围是否在95%置信区间内来评估临界值是否准确（图2-5-3）。灰区的理想范围是在高、低端各95百分位之间。

（2）与定量检测不同，定性免疫检测方法在验证和确认过程中确定检测的临床灵敏度和特异性十分重要。临床灵敏度和特异性的评估是通过将临界值检测结果与患者样本实际情况比对而进行的。如前文所述，高灵敏度通常是定性检测设计的主要目标。因此，检测方法在实现高灵敏度同时可能会出现一些假阳性结果，这种情况是可以理解的。对于临床特异性和灵敏度评估时，建议选择日常工作条件（如规范的样本采集和处理流程）对检测方法的假阳性率和假阴性率同时进行测试。

（3）检测性能需要通过有效的方法学对比进行评估。理想情况下，新建检测方法的所有性能评估都应与成熟产品进行直接比较。比对时的样本选择应当谨慎，除了明显的阴性和阳性样本，还应确保有一定数量的样本在临界值附近和处于灰区。测试的结果应根据预定标准，使用定性（是或否）结果的符合率来评估。在某些情况下，使用可量化的S/CO比值变化来评估方法之间的相关性也可获得有用的信息。如果评估中有不一致的结果，应尽可能对这些结果进行确认，例如：

● 通过在其他测试系统中进一步评估不一致的样本；

● 通过使用替代方法或标志物，包括亲合力测试；

● 通过回顾患者的临床状况和诊断；

● 通过测试后续样本。

定性方法的性能评估通常比定量方法复杂得多。在评估中，引入一组已知分析物浓度的样本或（如果不能确定样本浓度）一组通过参考方法或金标准方法确定的具备不同响应水平的样本会对评估效果有很大帮助。

三、结束语

在世界各地的临床实验室中，越来越多定性检测被应用于不同的场景中。针对定性免疫分析，目前市面上仍没有系统性专著，本节基于经验和最佳实践提供了相关介绍和指引。原则上，定性检测旨在为样本定性和分类提供快速、简单和可靠的“是或否”结果。与定量检测相比，定性检测的设计具备自身的特点，尤其是定性检测中与临界值确定过程相关的部分。由于定量检测的分析特性不能直接适用于定性检测，因此定性检测必须根据其自身的特点进行确认。

免疫检测技术的发展十分迅速，相应的需求量也逐年增多。在过去的20年中，定性测试的应用场景大幅增加。亚洲和非洲作为新兴市场，传染性疾病仍然流行，其对于定性检测的需求也在不断增长。

血清学检测通常用来检测传染病病原体和对应的抗体。检测常采用半定量或定性方法，并要求高灵敏度。定性检测能够提供快速和明确的结论，满足用户相关的需求。在定性检测的产品设计中，简明的信息、直接的结果、先进技术的应用以及自动化和小型化将是未来的发展趋势。

四、参考文献和进一步阅读

（吴令嘉、于丽娜　译，何建文　审）