第六节 传染病相关抗体的检测

实验室对疑似（现症或既往）感染性疾病的调查研究可以通过检测来自可疑微生物的抗原、检测机体应答可疑微生物形成的抗体，或者检测可疑微生物的DNA或RNA等微生物检测方法来进行。这些方法都各有利弊：整体来说，微生物检测方法需要至少24h才能完成，并且许多微生物无法成功培养；对抗原检测而言，有时抗原水平可能由于过低而难以检测；抗体在感染后1～4周内无法检测，甚至在某些个体中无法被检出；最后，DNA和RNA的检测方法在多数情况下不能确定患者当前的感染状态，而且由于循环水平过低无法用于某些微生物的检测。

当需要进行全面调查以明确感染的性质时，可以同时采用上述方法，但相应的研究成本可能大幅增加。在多数情况下，可以选择其中一种方法以解决研究中所关心的某一特定问题，而其中抗体检测方法最为常用。例如，在确定机体对风疹病毒的免疫力时，由于风疹病毒难以被检出，可以依据检测相应的抗体确认由实际感染或免疫接种产生的免疫力，即采用抗体检测较为合理。如果医生怀疑患者的感染发生在过去的数周或数月内，那么抗体检测是最实用的确诊方法，如梅毒或莱姆病的诊断。抗体还能提供信息来区分近期感染和既往感染。例如，EB核抗原1（EBNA-1）IgG抗体在急性EB病毒（EBV）感染时并不存在，因此在检测不到EBNA-1 IgG抗体的患者中检测EB病毒衣壳抗原（VCA）IgM和/或IgG抗体，有助于确认活动性感染。

大多数免疫分析方法都是用来检测明确的实体，包括小分子或蛋白质，而不是抗体。要检测抗体时，需要了解与检测方法开发相关的抗体特性，包括亲和力、亲合力和同种型。此外，抗体识别表位有时可能并不明确，即表位在不同个体之间、疾病不同阶段以及同一微生物的不同毒株之间都有可能存在差异。免疫检测方法的设计必须考虑到这些特征，而抗体的多样性要求检测方法的设计同样具备多样性。

免疫系统是一个高效的制造场所，因此抗体检测的一个优点是其浓度通常相当可观。对需要早期检出的免疫检测方法，如HIV抗体的检测，其可能需要方法具备很高的灵敏度。但是，当抗体在B细胞中稳定产生后，抗体浓度大幅升高，此时检测方法只需要适度的灵敏度即可。另一方面，抗体检测的校准非常困难。抗体的合成通常耗时且昂贵，因此人源性物质常被用于校准。然而，人类抗体的亲和力、亲合力和表位特异性可能存在差异，给检测方法的校准带来了相当大的挑战。重组抗体应用正逐步扩展，未来可能为抗体检测方法的校准优化提供机遇。

一、检测模式

当前几乎所有抗体免疫检测方法的共同特征是将目标抗原与固相结合。快速检测通常使用反应条，而临床化学领域通常选择基于微球的检测方法。单项检测可以在罗氏、西门子、雅培和其他制造商的仪器中实现；多重检测则可以使用Luminex仪器及其相关技术进行。 酶联免疫吸附试验（ELISA）易于制备，并且可以使用廉价设备在几乎所有实验室中进行，因此被广泛地用于抗体检测。平面阵列技术以ELISA原理为基础进行扩展，允许多种抗体的同时检测。详见第四部分第一节“ELISA开发实用指南”。

当对检测特异性有极高要求时，如血液中心筛查场景下，可以采用双抗原夹心检测技术。在这种模式下，抗原以低密度被固定在固相上。抗体的其中一个识别位点将与这个靶抗原结合，另一个识别位点保持未结合状态。在清洗步骤后，加入另外一种已预先与标记的检测抗体结合的抗原，从而更好地保障目标抗体被正确识别和捕获。但是，这种技术的缺点是难以区分抗体的不同分型。

二、检测方法研发

（一）捕获试剂的选择

捕获试剂是构建免疫检测方法的基础，因此选择捕获试剂是开发用于量化目标分析物的特定检测方法中最关键步骤之一。捕获试剂应与目标分析物特异性结合，所以在选择捕获试剂时，特异性可能是最重要的考虑因素。为了检测针对感染因子的抗体，最好的捕获试剂是感染因子本身的免疫原性部分。研究人员可以在计算机上运用表位建模软件预测高免疫原性区域。但通常推荐通过实验来确定感染因子的高免疫原性区域信息，其结果更为可靠。例如，可以测试经免疫反应（比如，病毒灭活株或减毒株）产生的抗体与来自感染因子的蛋白质之间的反应性，以确定后者哪些蛋白质最具免疫原性。免疫原性蛋白质可以通过多肽或突变体进一步定位免疫原性表位。

在选择捕获试剂时还应考虑物种间的特异性差异，即如果该检测方法旨在测试针对感染因子不同毒株的抗体，则捕获试剂在这些毒株之间应该足够保守。反之，可能需要具有毒株特异性的捕获试剂。人们还应该考虑抗体反应的异质性（见下文）。推荐选择一种免疫显性抗原以确保大部分（即使不能全部）含抗感染因子抗体的样本能被检测出。

一旦识别出潜在的捕获试剂，就可以根据其结合亲和力和特异性来进行筛选。为此，建议在相应物种中制备多克隆抗体作为阳性对照。所选择的捕获试剂应在目标基质（如人血）中表现出较高的结合亲和力和特异性（通过低本底和缺少基质干扰来评估）。如果捕获试剂与基质的内源性蛋白质相互作用，将导致检测背景信号升高及假阳性结果的出现。

当捕获试剂被固定在固相上时，必须保留其与目标分析物结合的能力。基于捕获试剂的非极性部分与塑料基质之间的疏水作用，捕获试剂能够固定在ELISA微孔板上。在某些情况下，包被过程可能会使捕获试剂用于与目标抗原结合所需的区域被掩盖或隐藏，导致无法有效地实现目标分析物的捕获。在这些情况下，可以将捕获试剂进行标记，并通过标记的捕获试剂与预先结合在微孔板上的高亲和力配体相互作用，从而实现固定化。常用的标记方式包括生物素标记（与带有亲和素的包被板结合），以及组氨酸标记（与带有镍包被板结合）。由于标记试剂的包被依赖于标记物（而非捕获蛋白质本身）与微孔板的结合，因此捕获试剂的结合区域可能处于更有利的位置，并且能更自由地与目标抗体结合。在进行标记时，需要着重关注试剂被标记的位置和程度，以确保该标记过程不会改变试剂的结合活性。

（二）检测试剂的选择

检测试剂的作用是结合目标抗体，并提供可量化的信号以供测量。最常见的情况下，酶（如辣根过氧化物酶，HRP）与检测试剂结合，并与相应的底物（如四甲基联苯胺）反应以产生与结合的目标抗体数量成比例的显色信号、化学发光信号或化学荧光信号。市面上有大量的商品化酶标记试剂可以实现上述目的。但是，如果酶与目标检测试剂偶联不便，也可以采用二级检测试剂代替。例如，如果使用自制的小鼠单克隆抗体作为一抗，则可以使用商品化HRP标记的羊抗鼠抗体作为二抗以产生检测信号。在选择酶标记物时，应考虑温育温度、缓冲液组成、pH、酶的稳定性以及对辅酶因子的要求等。与所有的检测试剂一样，酶标记物的使用浓度应该针对每一种检测方法进行优化。

灵敏度是选择检测方法时最重要的考虑因素之一，如表2-6-1所示。尽管显色法的灵敏度比化学荧光法和化学发光法低，但这并不一定是缺点。高度灵敏的检测方法更容易因封闭液或稀释液发生随机性微小变化而受到影响。因此，合适的检测方法通常提供等于或低于试剂预期检测范围的信号。如果试剂的预期检测范围在较高的pg或µg级别，则首选显色检测，而化学荧光或化学发光检测则更适合更低检测下限的检测（如较低的pg或fg级别）。基于电化学发光技术的Meso Scale Discovery（MSD）平台（www.mesoscale.com）通常用于开发灵敏度高、线性范围宽的检测试剂。MSD使用钌标记检测抗体，在对MSD微孔板电极表面启动电化学反应后，会发出与样本中抗体浓度成正比的光信号。光信号经过多个激发周期放大以增加灵敏度，同时检测体系保持较低的背景信号，以获得良好的信噪比。

（三）封闭缓冲液

ELISA板中微孔的结合容量通常会超过用于包被的捕获试剂的数量，因此需要利用封闭液（blocking solution）进行封闭。封闭液包含与免疫反应不相关的、无免疫反应性的蛋白质。这些蛋白质能包被微孔的剩余表面，以减少测试样本或检测试剂中蛋白质的非特异性结合。表面活性剂也能够有效地降低蛋白质的非特异性结合。常用的封闭成分包括白蛋白、酪蛋白、牛奶、Tween®、Triton®和硫酸葡聚糖。封闭成分的有效性取决于测定过程中的多种组分，其中最重要的可能是待测分析物的基质。

非特异性结合的一个明确指标是当目标抗体（即待测分析物）不存在时产生背景信号的强度。较高的背景信号会显著降低检测方法的信噪比，从而限制了方法的检测范围。除了在包被后立即封闭微孔板外，在随后的清洗步骤中加入封闭蛋白质或表面活性剂也有助于降低背景信号。推荐通过实验来确定最佳的封闭条件，包括封闭液中封闭蛋白质或表面活性剂的浓度以及封闭过程的温育时间和温度。最佳封闭组合可以通过评估不同条件下对背景信号和信噪比的影响来确定。

（四）待测抗体的异质性

机体对感染因子的免疫反应所产生的抗体几乎都是多克隆抗体。因此，目标抗体群通常非常多样，并与感染因子免疫原性成分的数量相关。为了确保检测中不遗漏阳性样本（假阴性），在试剂设计上需要对个体的全部抗体实现检测，这一点十分重要。这类检测试剂可以选择将用于捕获的免疫显性蛋白质或表位与通用的检测试剂（如抗物种特异性IgG抗体）进行配对。

（五）同种型特异性

抗体同种型分型可以用来鉴别目标抗体的血清学类别。分型通常能更好地表征抗体，并提供与抗体反应相关的有用信息（如反应时间和抗体结构）。在使用ELISA检测时，目标抗体的同种型可以通过捕获或检测对抗体同种型（如IgG和IgM）特异的抗体来确定。在市面上可以购买到这些同种型特异性抗体（其通常为试剂盒形式，用以确定目的抗体类型）。其他的一些方法，包括琼脂糖凝胶扩散和同种型“试纸条”分型试剂等也可以用于抗体分型。与ELISA试剂类似，人们可以利用同种型特异性对目标抗体进行分型，但在不清楚目标抗体分型的情况下研发检测试剂需要避免同种型特异性的情况。

（六）疫苗免疫研究的特殊考虑

由疫苗引发机体针对特定抗原的抗体应答能力可以通过定量免疫测定来评估，其最终结果可以以抗体滴度的形式报告。商品化试剂盒可用于针对常见疫苗抗原的定量抗体滴度分析；然而，罕见疫苗或实验性疫苗则需要研发新的免疫检测方法。由于机体对疫苗的抗体应答因人而异，因此形成可推算抗体绝对浓度的校准曲线是不现实的。为此，抗体滴度的定量检测通常是通过对待测样本连续稀释来进行，其最终滴度报告为产生高于本底的可靠信号时的最高样本稀释度。抗体的含量并不是了解疫苗免疫应答的唯一重要因素；抗体应答动力学同样重要，通常通过加入同种型特异性检测抗体（如上述）来跟踪抗体应答的动力学特征。

三、方法确认

（一）定量范围

免疫检测的定量范围（quantitation range）应符合可接受稀释水平下未知样本的预期抗体浓度。定量范围由定量的上限值和下限值进行定义。利用上下限以及介于两者之间的四种建议抗体浓度对应样本相对于已知对照样本产生的信号生成校准曲线，然后根据未知样品测定过程中产生的信号，利用校准曲线来确定未知样品中抗体的浓度。

经确认的定量范围要求已知抗体浓度的对照样本需具有可接受的精密度和准确度。除了校准曲线各个点（校准品）的抗体浓度外，至少高、中和低浓度（相对于定量的上限和下限）的对照样本也必须具有可接受的准确度和精密度。方法学准确度的定义是通过该方法获得的测试结果与对照样本已知浓度的接近程度，通常以相对误差（relative error）表示。检测精密度的定义是指在同一微孔板内（批内）或不同微孔板间（批间）多次进行重复检测时的抗体浓度的接近程度。当前管理指南，如来自美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）建议，经确认的抗体定量检测方法准确度的相对误差应为已知抗体浓度的±20%和精密度的变异系数≤20%。有关指标确认的参数信息可以在当前的管理指南和行业白皮书中找到。

（二）稀释线性

如上所述，免疫检测的定量范围应与可接受稀释度下测试样本的预期抗体浓度相适应。当待测样本中抗体浓度超出定量范围时，通常需要稀释以使抗体浓度落在定量范围以内。为了展示样本可以被稀释的程度并且通过反向计算获得准确的目标抗体浓度，应该对稀释线性进行评估。通常将高浓度的抗体投入到待测样本的基质中，并对该样本进行连续稀释，以使其检测结果浓度值落在分析的定量范围内。当落在定量上、下限之间的80%的检测结果经反算（乘以稀释因子）得到的浓度在已知抗体浓度±20%以内时，稀释线性性能是可接受的。将满足上述标准的最高稀释倍数定义为稀释极限（limit of dilution）。

需要特别注意，如果稀释前目标抗体理论上应该产生高于定量上限的信号，但实际上却落在定量范围内，这表明测定中可能存在前带（prozone）效应，也称高剂量钩状效应（high-dose hook effect）。这种情况可能在抗体水平相对于检测试剂过量时发生，从而使捕获和检测试剂的结合力饱和并抑制了信号的产生。当检测方法疑似存在钩状效应时，测试者需要格外留意。为了避免低估抗体的高浓度水平，建议在多个稀释度下对测试样本进行检测，以展现稀释线性，即平行样本（parallelism）。

（三）选择性和特异性

选择性（selectivity）是评估当测试样本基质（如血浆）中含有其他物质的情况下，方法检测出目标抗体的能力。类似地，特异性（specificity）是评估检测试剂与目标抗体结合的能力，尤其是当测试样本中预期存在结构相似的化合物或潜在交叉反应物时。为了确保在目标抗体不存在时不会产生高水平的信号，选择恰当的捕获和检测试剂至关重要。为了评估选择性，应在独立批次的空白样本基质中加入目标抗体，并测量抗体浓度以计算每个样本的回收率。如果至少80%的测试样本中抗体的回收率是已知抗体浓度的±20%，则认为该方法的选择性是可以接受的。同理，特异性的评估可以通过将抗体加入已添加已知浓度潜在交叉反应物的样品基质中来进行。如果与已知浓度的加标样品相比，含有潜在交叉反应物情况下抗体的回收率在80%～120%的相对误差范围内，则特异性可接受。此外，对于仅含有潜在交叉反应物的样本，其测定结果应低于定量下限。

（四）稳定性

在任何确认试验中，确认分析物在待测样本储存条件下（储存时间和温度）保持稳定是十分重要的。抗体在长期冷冻的条件下可以在很长时间（如1年）保持相对稳定；然而，非理想的储存条件和反复多次的冻融会导致样本内物质降解。通常可以通过制备多个水平的质控品（在适当的基质中加入抗体）来模拟测试样本以评估其稳定性。测试的时间和温度应该反映样本可能的存储条件，并且还应该包括样本处理过程中可能发生的潜在误操作（如样品留在工作台上）。常见的稳定性评估实验设计包括在室温和冷藏温度下进行短期评估、冷冻条件下进行长期评估以及反复冻融下评估。当至少2/3的稳定性评估样本和每种浓度水平的50%或以上样本结果符合该方法设定的准确度和精密度要求时，稳定性可接受。

四、仪器

对于简易的试纸条检测，通常采用目测观察而无需仪器。试纸条测试费用低廉，可以在传统实验室之外和设备有限的国家使用。抗体在干燥时通常会保持稳定，所以血斑可以在偏远地区中收集并转移到检测中心进行洗脱，从而进一步增强检测方法在发展中国家的适用性。

ELISA设备应用广泛，可支持显色、荧光或化学发光检测技术。为了提高通过量，可以使用机械设备实现自动化吸样、移液和清洗等步骤，其还可以同时处理2～16块微孔滴定板。由于ELISA中抗体浓度较高，温育时间一般选择30～60min，所以ELISA测试的总耗时为2～3h。

自1997年多重微利分析技术出现以来，该技术已得到广泛应用。在许多情况下，医院需同时测定多种抗体以辅助病人的诊疗。例如，为了建立儿童期感染的免疫力，医院通常要求同时检测流行性腮腺炎、麻疹、风疹和水痘（MMRV）抗体。在本书中描述的Luminex 200系统被广泛用于上述检测，而抗原阵列也可以实现多种抗体的同时检测。

五、应用

目前已有相当多的感染性疾病可以通过血清学检测来鉴定。下述总结了关于血清学检测的一些更重要的应用以及部分新兴用途。

（一）血库检测

为确保血液供应的安全，血库必须对献血人员进行传染病筛查。通常包括艾滋病、肝炎和梅毒检测；在某些病原体流行的地区还需进行其他传染病的筛查，如人T淋巴细胞病毒（HTLV）、疟疾和锥虫病。

HIV检测必须具备高灵敏度和高特异性，因此其相关检测方法的要求在当前已有免疫分析项目中可能最为严格。在实验室中，目前的HIV第四代试剂必须具有超过99.5%的灵敏度和99.7%的特异性；对用于社区诊所的快检试剂来说，其要求略为降低。为了满足特异性的要求，一些制造商采用夹心法的模式进行检测，即HIV抗体的一只臂识别固定于固相表面的靶标分子，另一只臂识别偶联了酶或其他标记物的抗原，最终通过荧光和化学发光信号来检测。如果IgG和IgM抗体均存在，检测方法必须能同时检出。此外，无论采用何种初筛方法进行检测，阳性结果都必须进行确认。过去，常用免疫印迹法（Western blot）作为确证试验；如今筛查试验的灵敏度可能超越了免疫印迹法，因此需要采用诸如基于聚合酶链反应（PCR）的核酸扩增试验（NAAT）来进行补充检测。最后，HIV是一种具有多种血清型的病毒，因此检测试剂必须能够识别足够广泛的抗体类型以检出各种血清型以及HIV-2这一种基因序列有显著差异的不同病毒株。图2-6-1举例说明了实验室应进行HIV抗体的筛查和确认的基本流程。

（二）确认急性疾病状态

通过抗体检测可以确认许多疾病是否处于急性期。传染性单核细胞增多症是儿童和青少年中的一种常见传染病，数十年来人们一直采用一种检测“嗜异性抗体”的简便方法来辅助诊断。这种方法采用试纸条的形式，用于检测存在于人血清中且能与绵羊或马的血液提取物反应的抗体。目前，针对EB病毒VCA抗原的IgM抗体检测灵敏度更高，并常作为优选方法；但该检测方法一般只在提供全面服务的实验室采用。关于感染后的其他情况可以利用EBV VCA IgG和EBV早期抗原（EA-D）IgG抗体来确定。最后，因为EBNA IgG抗体通常在初次感染后3个月出现，因此若未能检测到上述抗体则可以排除患者处于感染晚期或二次感染的可能。图2-6-2汇总了这些抗体出现的先后顺序。许多医生没有接受过解读检测结果的训练，而技术的进一步发展可能会继续改变这些测试的使用方式。例如，在2 000年以前，EBNA抗体的检测均采用间接免疫荧光法。该方法可以检测多种EBNA分子，同时包含早期和较晚阶段出现的分子。然而，所有现代方法检测的抗重组EBNA-1蛋白抗体均是在感染较后期才形成的，因此提高了检测的实用性。

（三）影响妊娠的病原体

抗体检测的另一个主要用途是筛查孕妇是否患有可能传染给其子女的疾病。这类筛查与血库筛查不同，因为前者只有活动的、未经治疗的传染病才有意义。这类检测包括弓形虫、风疹、巨细胞病毒（CMV）和梅毒感染等，某些国家也把单纯疱疹病毒（HSV）的检测包括在内。筛查试验包括IgG和IgM抗体，而近期感染有时仅能通过IgM抗体的检测来发现。

（四）疫苗有效性

前文提到了医院工作人员对麻疹、腮腺炎、风疹和水痘带状疱疹病毒的检测，并且还报道了用于白喉、破伤风监测的多种方法。此外，新疫苗的开发一般需要进行抗体检测以确定制剂是否能有效地引起免疫反应，该过程减少了对烦琐的中和试验的需求。近期引进的人类乳头瘤病毒和肺炎球菌疫苗便得到了快速抗体筛查的极大帮助。

（五）移植和免疫抑制监测

许多用于监测急性感染、妊娠期疾病和疫苗接种功效的检测对于在移植前评估供体和受体具备价值。例如，来自EBV或CMV感染供者的器官可能会导致未曾感染过的受者出现严重疾病。抗体筛检费用低廉，有助于发现潜在风险。后续检测通常需要NAAT来确认是否存在活动性感染，在某些情况下还需要确定病毒载量。器官受赠者为降低排斥风险而引发的免疫抑制状态可能会导致潜伏病毒（CMV、EBV或HSV）致病，使患者和器官都处于危险之中。

（六）流行病学

鉴定新的传染病通常需要确定当地人口中疾病暴发的流行性情况，如汉坦病毒。此外，对动物种群的检测也有助于确定可能携带该疾病的物种。这些研究可以通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析来补充，并鉴定出了长期散播汉坦病毒的动物——鹿鼠。此外，许多患者可能已经暴露感染但尚未表现出症状；利用血清学检测，则可以更准确地确定该病的真实发病率。在1999年纽约市西尼罗病毒暴发期间，据称只有1%的感染者报告了症状。

（七）动物实验

用于研究的动物可以通过定期检测以确定是既往感染或现症感染。由于动物实验通常采用小鼠或大鼠进行传染性疾病测试，因此可以同时筛查多种感染的多重分析方法逐渐流行。同样，家畜也经常在兽医诊所中接受传染病筛查。

（八）生物战

对于炭疽等急性病原体而言，在生物战攻击事件中通常并不会首选抗体检测。然而，在其他情况下，当局可能必须进行广泛的抗体检测，以确定传染病的流行程度。与此同时，抗体检测还可帮助有过病原体接触史的人群排除感染可能。

六、扩展阅读

（周宏伟　译，何建文　审）