第七节 基于微球的多重免疫分析：Luminex®xMAP®技术的发展和应用
多重分析是指能够同时检测多种分析物的技术，与传统的单一分析物检测技术相比，它具有多种优势并逐渐成为研究和诊断实验室的首选检测方法。通过使用不同染色的功能化微球，Luminex® xMAP®技术平台能够快速地对同一个样本进行多重检测和定量分析。与单一靶标检测技术相比，Luminex® xMAP®技术更经济且检测性能更好。由于标准品是以共价方式包被于xMAP微球上，因此该方法可广泛应用于包括蛋白质、核酸、多糖类和磷脂类在内的多种生物分子的检测中。基于微球的多重分析平台迅速流行，目前已超过9 000台仪器在全球投放，同时Luminex公司及其合作伙伴提供了丰富的检测项目清单。
除了适用于xMAP平台的诸多商品化检测项目，该技术框架开放，用户还可以根据自身需求快速开发、优化和验证某些定制项目。目前有超过14 000篇同行评议刊物报道基于xMAP技术的检测方法在研究和诊断中的应用和/或开发，表明该技术具有广泛的用途（Luminex Corporation，2010a）。在本节中，重点介绍xMAP技术在免疫检测中的应用，包括检测方法的开发、优化以及不同免疫学方法的样本处理流程，并提供一些仪器、项目清单以及推荐的参考文献。
一、xMAP技术
xMAP分析系统是由悬浊液阵列（液态芯片）组成。微阵列中特异性捕获分子共价偶联于染色的微球表面，分析物与捕获分子的结合反应发生于微球的表面。根据所使用的Luminex分析仪，微球可制成能够检测100～500个分析物的阵列。分析物的结合能够通过荧光报告基团进行检测。藻红蛋白（phycoerythrin，PE）荧光量子产率高，多数情况下被选作荧光报告基团。Luminex分析仪根据微球自身的荧光信号识别、鉴定、分类微球，并通过PE的发射强度定量测定微球表面结合的分析物。与传统的二维检测模式相比，该方法具有几大优势，包括由良好的近液相结合动力学所致的较短孵育时间、重复性高、灵敏度和特异性好、样本用量少且通量高等（Nolan and Mandy，2001；Nolan and Sklar，2002；Kellar and Iannone，2002；Kellar，2003）。
二、xMAP微球
xMAP技术的关键部分是聚苯乙烯微球，利用两种或三种光谱差异大的荧光染料按精确比例混合，对微球进行染色。每种类型的多重分析微球大小一致，但微球内部的荧光染料之间的比例不同。尽管这些荧光染料的激发条件相似，但是其发射光谱特征独特。因此，每个或每种微球的光谱特征是独一无二的，从而使多重分析中每个或每种微球能够与其他微球区分开来。由于每个或每种微球都共价偶联了一种特定的捕获试剂，并可通过荧光报告基团的信号进行区分，因此每个或每种微球都对应一种特定的分析物。当这些微球混合在一起，可在同一个反应体系中同时检测多种分析物。分析时，通过荧光报告基团可以定量检测分析物，微球内部荧光可从多重数据中去卷积。
为了满足各种应用需求，目前已经研发出多种商品化xMAP微球并可用于免疫检测应用开发。第一代xMAP微球是根据内部两种荧光染料的光谱特征进行区分，它可以提供100种光谱不同的微球阵列。如果使用三种荧光染料可以将微球阵列扩增至500种（图2-7-1）。原始未包被的MicroPlex®（裸球）是直径为5.6µm的聚苯乙烯微球，携带的羧基可以共价结合捕获分子，并可提供500种不同的颜色组合。LumAvidin®微球表面包被抗生物素蛋白，它能够结合生物素化的捕获试剂。这种检测技术使分析物由于生物素和抗生物素蛋白的间隔远离微球表面，使反应保留足够的空间。通常，对于小分子或多肽类分析物的检测，这种方式具备更优的反应性能。然而，如果使用LumAvidin®微球，就不能使用生物素-亲和素检测系统。SeroMAP™是针对血清学检测中出现的高背景而专门研发的微球。SeroMAP™是直径为5.6µm的羧基化微球，可提供100种不同的颜色组合。其设计可减少非特异性结合，在血清检测中具有出色的表现（Waterboer等，2006）。MagPlex®是直径为6.5µm的超顺磁性微球，表面具有羧基功能基团，可提供500种不同的颜色组合。MagPlex微球可以通过磁力作用与溶液分离，因此更易于自动化和便于洗涤。与SeroMAP™微球的组成相似，MagPlex微球可减少非特异性结合，背景更低，它在血清学检测中具有优异的检测性能（Luminex Corporation，2008a）。目前，市面上已有MagPlex微球和商品化磁力洗板仪联用的方案，Luminex和其他供应商也提供手持式磁力架用于手工洗涤MagPlex微球（Luminex Corporation，2007b，2010b）。
图2-7-1 Luminex微球图
注：（a）100个微球阵列的二维图，x轴代表1类染色（CL1），y轴代表2类染色（CL2）。灰色椭球代表100个微球区域（颜色簇）的位置。（b）500个微球簇的三维图，x轴是CL2，y轴是3类染色（CL3），z轴是CL1。灰色椭球代表500个微球区域的位置。这个软件允许用户放大微球图的特定区域（微球的切面）以获得更详细的视图。（c）MAGPIX®仪器可以提供100个微球阵列图谱中的50个微球区域
三、Luminex分析仪
Luminex 100/200™和FLEXMAP 3D® 是两种基于流式细胞术的仪器（图2-7-2）。在这些检测系统中，样品探针从96孔板或者384孔板中吸取包含微球的反应体系，样本在流体动力学驱动下聚焦成一束快速流动的液流。当液流通过成像室时，每个微球都会受到两种激光的照射。波长635nm、10mW的红色激光器激发每个微球内部的荧光染料，发射的荧光经由雪崩光电二极管进行检测，侧向散射光用于滤除空气和磁珠聚集，鉴别每一个微球，并排除气泡和微球聚集体。波长532nm、13mW的钇铝石榴石激光器激发微球表面捕获的报告荧光基团（PE），其发射光经由光电倍增管（PMT）进行检测。高速数字信号处理器通过微球内部荧光信号判定微球的荧光编码，而微球表面的荧光报告基团信号强度可以实现对待测物的定量测定。每一种微球都要进行多次读数以确保结果稳定可靠。报告通道读数取自微球液滴周围的信号并通过专门的减数计算而作为背景被扣除。通常情况下，每孔每个区至少检测50或100个微球，结果以荧光强度中位数（MFI）报告。当每个样本每个区域吸取的微球足够少时，使用中位数统计可以很好地避免孔间的携带污染。
图2-7-2 Luminex分析仪
注：（a）Luminex® 200™系统包括Luminex 200流式分析仪，Luminex XYP™检测板装卸平台，Luminex SD™鞘液输送系统，xPONENT®软件和计算机。（b）FLEXMAP 3D™系统的分析器，检测板装卸平台和鞘液输送系统都集成在一个单元内，还包括xPONENT®软件和以铰接臂容纳显示器和键盘的计算机。（c）MAGPIX®是基于CCD成像技术的小型化系统。xPONENT®软件提供简化的启动和关闭程序以及最低的维护要求
Luminex 100/200™分析仪在诊断和研究领域都有广泛的应用，其拥有超过50个510（k）许可的试剂盒以及许多终端用户实验室研发的测试（laboratory-developed test，LDT）。在Luminex 100/200™上，MicroPlex微球可以检测高达100种不同的分析物，MagPlex微球可检测的分析物也多达80种。该系统稳定灵活，应用广泛，可用于免疫检测、基因分型、基因表达、酶学分析和感染性疾病检测等领域。通常，这一技术只需几微升的样品就能检测多达100种分析物，因此该技术尤其适用于稀有样本或者体积有限的样品。这种方法的检测结果与其他方法如酶联免疫分析（ELISA）高度一致，而且可以对超过3～4数量级浓度范围的分析物进行定量测定。Luminex系统自带的xPONENT软件十分直观，使得自定义检测和商品化检测试剂盒的检测设置、反应板读数和数据分析非常便捷。每个项目都有特定的实验方案，而且可重复用于新批次的测定。美国《联邦法规21章》（美国——译者注）第11款规定的兼容升级可以提供多级用户管理、全程追踪、电子档案和电子签名，该系统也被批准用于体外诊断（IVD）。
FLEXMAP 3D系统是Luminex研发的第二款基于流式的分析平台，它的灵敏度更高，检测范围更广，通量高达500种分析物，工作效率更高。此外，这款仪器的设计更易于自动化，且可连接实验室信息管理系统（LIMS），而且同时兼容96孔板和384孔板。该系统还能自动调整样品探针的高度并具穿刺功能，能够分析密封的反应板。它可以设计双进样系统提高工作效率，分析速度是Luminex 200的2～3倍。在该系统中，96孔板的检测时间大约为20min，384孔板的检测时间约75min。FLEXMAP 3D系统还带有方便的校准程序以及日常维护功能。由于浓度检测范围提高至4.5个数量级，之前由于水平差异巨大而需要分孔检测的分析物现在可以在同一个检测中进行多重分析。FLEXMAP 3D这种特性和能力成为快速和高通量检测的理想方法。
第三种系统MAGPIX®使用磁性微球，并采用流式细胞和CCD 光学成像技术，一次可检测多达50种分析物（图2-7-2c）。在MAGPIX系统中，已结合靶标的磁性微球通过鞘流池进入成像室，在磁场的作用下，磁性微球被吸附固定并与液体分离，以进行光学分析。红色激光器（630nm）激发微球内部荧光染料，绿色激光器（515～521nm）激发磁珠表面的荧光报告基团。CCD成像仪识别微球和定量分析报告基团。MAGPIX分析仪的xPONENT操作系统，既可用于商品试剂盒的操作，又可用于LDT项目的检测。由于成本低、体积小（仅需64.8cm的工作台空间），MAGPIX是中小实验室最理想的多重检测平台，也可用于偏远地区实验室。
四、检测项目开发
xMAP技术为用户提供了一个灵活、开放的平台，用户可以构建自定义检测项目，也可以使用Luminex与合作伙伴开发的商品化或定制检测试剂盒。Luminex网站上的技术支持提供样本操作流程、建议以及各种信息以帮助用户的项目开发（Luminex Corporation，2011d）。Luminex向用户提供现场版和网络版xMAP项目开发教程。许多出版刊物也对特定xMAP应用的项目开发提供了详细说明，下面介绍xMAP用于免疫学项目开发的通用流程和建议。
检测项目开发首先必须准备所需试剂，包括抗体、分析物、标准品/质控品和基质等。如有必要，偶联剂可以采用（外源性）纯化的伯胺（如载体蛋白、三羟甲基氨基甲烷等）。通常，采用公价方式使微球与捕获试剂（如抗体、蛋白质等）结合，而未结合的试剂则会被除去。微球的结合反应必须在缓冲溶液中进行，并选用适当的检测试剂（如偶联鼠源性单克隆抗体的微球应该使用抗小鼠IgG）。在检测前，需对检测系统基质效应进行分析以评估非特异性结合和交叉反应性，同时使用与样本类似的阳性对照，以评估阳性反应、方法学的灵敏度和特异性。
通常，其他品牌的单靶标免疫学试剂在xMAP平台上也具有良好的性能，且能够提供足够的灵敏度和特异性。此外，除了含氨基化合物的缓冲液不能用于偶联微球（如Tris），其余标准的免疫缓冲液也能用于xMAP平台。 表2-7-1列举了用于偶联微球和xMAP免疫检测的各种缓冲液（Luminex Corporation，2007a）。Luminex网站提供有经过验证的试剂、材料和设备的综合清单，其均可与xMAP技术平台兼容（Luminex Corporation，2011b）。
（一）微球偶联
抗体或者蛋白质上的伯胺可以通过标准的碳二亚胺二步偶联法与微球表面的羧基基团共价结合。某些常用的蛋白质添加剂会影响偶联反应，如一些含氨基化合物包括Tris、BSA、叠氮化物以及某些表面活性剂、甘油、尿素和咪唑等。这些化合物可以通过透析或者脱盐的方式从蛋白质制品中除去。在某些情况下，干扰物质如表面活性剂或尿素不能去除，那么必须充分稀释偶联蛋白以提高偶联效率。碳二亚胺偶联反应在低pH（如pH 5～6）时效率最高，但是它必须储存在低pH的缓冲液中才能确保其稳定和功能构象。当使用单克隆抗体将待测物捕获至微球表面时，检测系统可以获得最佳的灵敏度和特异性。如果使用多克隆抗体进行捕获，它必须是单特异性的并且经过亲和纯化。捕获抗体的最适用量取决于其自身的效价，一般每100万个微球使用3～5µg时抗体达到最优效能。
下面概述如何使用二步碳二亚胺偶联法将蛋白偶联至（500万个）MagPlex微球上。MicroPlex微球或SeroMAP微球操作方案与MagPlex微球操作相同，只是在洗涤时不同微球分离纯化方式存在差异，其中前两者利用离心法（≥8 000g，离心1～2min）分离，而MagPlex微球使用磁分离。表2-7-2列举了MagPlex微球在偶联和洗涤过程中所使用的磁力分离器和96孔板（Luminex Corporation，2007b）。偶联微球的稳定性取决于偶联蛋白的稳定性，通常在适当条件下，偶联的微球可稳定保存1年以上（Luminex Corporation，2008b）。
1.MagPlex™微球碳二亚胺蛋白偶联两步法的操作步骤
（1）根据微球产品操作说明，重悬未偶联的微球。
表2-7-1 xMAP免疫测定缓冲液
注：1活化过程可使用50mM MES，pH 6.0～6.2的缓冲液，不影响结果。
2偶联过程可使用100mM MES，pH 6.0的缓冲液，不影响结果。对于某些蛋白质，偶联时提高pH可以增加溶解度和偶联效率。
3蛋白偶联替代缓冲液在pH 5～6时，偶联效率较低。
4也可用作检测缓冲液。
5也可用作洗液。
表2-7-2 适用于MagPlex微球的磁力分离器
（2）将5.0×106个微球转移至微量离心管［如USA Scientific（1415-2500）或Eppendorf Protein LoBind（022431081）］中。
（3）将微量离心管放置于磁力分离器上，分离30～60s。
（4）磁分离完全后在磁分离器上去除离心管中的上清液，当心不要搅动微球。
（5）将离心管从磁力分离器上取下，用100µl去离子水重悬微球，涡旋混匀，超声约20s。
（6）将微量离心管放置于磁力分离器上，分离30～60s。
（7）磁分离完全后在磁分离器上去除离心管中的上清液，当心不要搅动微球。
（8）将离心管从磁力分离器上取下，用80µl活化缓冲液（100mM磷酸二氢钠，pH 6.2）重悬微球，涡旋混匀，超声处理约20s。
（9）加入10µl 50mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS，用去离子水或者偶联缓冲液稀释），轻轻涡旋混匀。
（10）加入10µl 50mg/ml EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），用去离子水或者偶联缓冲液稀释），轻轻涡旋混匀。
（11）室温孵育20min，每隔10min进行轻轻涡旋混匀。
（12）将微量离心管放置于磁力分离器，分离30～60s。
（13）磁分离完全后在磁分离器上去除离心管中的上清，当心不要搅动微球。
（14）将离心管从磁力分离器上取下，用250µl偶联缓冲液（50mM MES，pH 5.0）重悬微球，涡旋混匀，超声处理约20s。
（15）重复步骤（12）和步骤（13），再偶联重复1次。
（16）将离心管从磁力分离器上取下，用100µl偶联缓冲液重悬已经活化和洗涤的微球，涡旋混匀，超声处理约20s。
（17）将蛋白质加入重悬的微球中。蛋白质量取决于自身的效价，一般每100万个微球偶联1～25µg蛋白质，最适量为每100万个微球偶联3～5µg蛋白质。
（18）加入偶联缓冲液补充至500µl。
（19）涡旋混匀。
（20）将微量离心管放于摇床上旋转混匀，室温孵育2h。
（21）将微量离心管放置于磁力分离器，分离30～60s。
（22）磁分离完全后在磁分离器上去除离心管中的上清，当心不要搅动微球。
（23）取出微量离心管，加入500µl PBS-T洗液或者PBS-TBN缓冲液，涡旋混匀，超声处理约20s。如果选用步骤（24），则这一步骤使用PBSTBN缓冲液。
（24）放于摇床上，室温孵育30min（注意：如果当天使用微球则选用本步骤）。
（25）将微量离心管放置于磁力分离器，分离30～60s。
（26）磁分离完全后在磁分离器上去除离心管中的上清，当心不要搅动微球。
（27）取出磁力分离器中的微量离心管，使用1ml封闭液/储存液（PBS-BN或者PBS-TBN）重悬微球，涡旋混匀，超声处理约20s。
（28）重复步骤（25）和步骤（26）。用1ml封闭液/储存液洗涤2遍。
（29）移除磁力分离器中的微量离心管，用250～1 000µl封闭液/储存液重悬偶联和洗涤的微球。
（30）将偶联的微球放置于2～8℃，避光保存。
注意事项：
① 在整个操作过程中，微球应该避免长时间的光照。
② 缓冲液的信息详见表2-7-1。
③ 磁力分离器的信息详见表2-7-2。
通常，利用小规模的偶联反应（250万～500万个微球）优化蛋白偶联的最佳条件，如偶联反应中抗原或者抗体的量。偶联反应的规模根据需要可以扩大或者缩小；但是每100万个微球中捕获试剂的比例应该是恒定的。活化缓冲液的体积、Sulfo-NHS和EDC的用量、偶联反应的总体积可根据偶联反应的规模和反应管的大小进行调整（Luminex Corporation，2007h）。以下是（2.5～200）×106个微球偶联反应的常规建议：①偶联（2.5～12.5）×106个微球需要活化缓冲液的体积是100µl，（50～200）×106个微球活化缓冲液的体积是500µl；②（2.5～12.5）×106个微球需要Sulfo-NHS和EDC是0.5mg（50mg/ml样品10µl），（10～50）×106个微球需要2.5mg（50mg/ml样品50µl），以及（100～200）×106个微球需要5mg（50mg/ml样品100µl）；③（2.5～5）×106偶联个微球偶联反应体系体积是0.5ml，（10～12.5）×106个微球反应体系体积是1ml，而（50～200）×106个微球是2ml；④0.5～1ml偶联反应体系的偶联可以在1.5ml离心管进行，2ml偶联反应可以使用4ml离心管或15ml聚丙烯管。
未偶联的微球黏性大，可黏附于大多数离心管管壁上。USA Scientific公司（货号#1415-2500）和Eppendorf Protein LoBind的离心管（货号#022431081）在偶联反应后微球回收率最好。此外，将偶联反应置于滚筒式摇床混匀器（VWR公司，货号56264-302）上可获得最佳偶联效率。在15ml聚丙烯管中进行的较大规模偶联反应，可将离心管倾斜置于转速300r/min的轨道微量滴定板摇床上。
用于偶联的其他化学物质，包括偶联蛋白和多糖，如4-（4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基）-4-甲基吗啉（DMTMM）可作为一步法偶联试剂代替EDC和Sulfo-NHS偶联。DMTMM比EDC和Sulfo-NHS更加稳定，因此它是一种微球偶联的稳健方法（Schlottmann等，2006）。其他用于偶联的化学物质，包括酰肼和马来酰亚胺也可将蛋白质共价偶联至微球表面。
肽类、磷脂和其他小分子可以直接偶联至微球表面（Komatsu等，2004；Shichijo等，2004），但是如果对这些小分子或偶联的微球进行修饰使微球表面有足够的空间可提高偶联的效率。该方法是利用接头序列或者载体蛋白连接小分子，再通过标准的碳二亚胺两步法将其偶联至微球表面。生物素化小分子可以结合到LumAvidin微球，其上偶联的抗生物素蛋白为微球表面提供结合的空间（Iannone等，2001；Drummond等，2008；Gu等，2008）。下文将讲述生物素化分子结合LumAvidin微球的实验方案（Luminex Corporation，2007c）。然而，这种生物素-链霉抗生物素蛋白系统不能用于标记荧光报告基团，这种情况下可能需要选择其他标记方法，比如将PE直接连接于检测试剂。
2.生物素标记分子结合LumAvidin微球的操作步骤
（1）根据微球产品说明，重悬LumAvidin微球悬液。
（2）将1.0×105个微球转移至USA Scientific（1415-2500）或者Eppendorf Protein LoBind（022431081）微量离心管。
（3）离心（≥8 000g）1～2min，收集微球。
（4）去除上清液，用250µl PBS-BSA重悬微球，涡旋振荡混匀和超声处理约20s。
（5）用PBS-BSA稀释生物素标记分子，采用滴定法确认最佳稀释浓度，滴定范围为4～4 000nM。
（6）将250µl生物素标记的分子加入微球悬液，立即涡旋混匀。
（7）室温旋转混匀、孵育30min。
（8）离心（≥8 000g）1～2min，收集结合的微球。
（9）移除上清液，用500µl封闭液/储存液（PBS-BN或者PBS-TBN）重悬，涡旋混匀。
（10）离心（≥8 000g）1～2min，收集微球。
（11）重复步骤（9）和步骤（10）两遍。
（12）移除上清液，用250～1 000µl封闭液/储存液重悬，涡旋混匀，超声处理约20s。
（13）将结合的LumAvidin的微球放置于2～8℃，避光保存。
注意事项：
① 在整个操作过程中，微球应避免长时间的光照。
② 缓冲液的信息详见表2-7-1。
另一种连接小分子的方法是将功能性的接头序列偶联至微球表面。这种交联试剂具有不同的功能基团，它们充当小分子和微球表面的间隔物。己二酸二酰肼（adipic acid dihydrazide，ADH）中的酰肼为偶联羧基基团提供10个原子的间隔序列，而4-（4-N-马来酰亚胺苯基）丁酸酰肼盐酸盐（4-（4-N-maleimidophenyl）butyric acid hydrazide hydrochloride，MPBH）为巯基基团提供8个原子的间隔序列。下文将讲述用ADH和MPBH羧基化修饰微球的实验方案。微球修饰后可用EDC一步法将捕获试剂偶联至修饰微球。
3.ADH修饰羧基化微球的操作步骤
（1）根据微球产品说明重悬微球悬液。
（2）吸取25×106个微球，离心（≥4 000g）2min。
（3）移除上清液，用1ml 0.1M MES（pH 6.0）重悬微球，涡旋混匀，超声处理约20s。
（4）将重悬的微球移至USA Scientific（ 1415-2500）或者Eppendorf Protein LoBind（ 022431081）微量离心管，离心（≥8 000g）1～2min。
（5）移除上清液，用1ml 35mg/ml ADH（ 用0.1M MES，pH 6.0配制）重悬微球，涡旋混匀。
（6）加入200µl 200mg/ml EDC（用0.1M MES，pH 6.0配制，现配现用），涡旋混匀。
（7）室温下旋转孵育1h。
（8）离心（≥8 000g）1～2min收集微球。
（9）移除上清液，用1ml 0.1M MES（pH 4.5）重悬微球，涡旋混匀。
（10）离心（≥8 000g）1～2min收集微球。
（11）重复步骤（9）和步骤（10）两遍。共洗3遍。
（12）用1ml 0.1M MES（pH 4.5）重悬微球，置于2～8℃，避光保存。
注意事项：
在整个操作过程中，微球应该避免长时间的光照。
4.MPBH修饰羧基化微球的操作步骤
（1）根据微球产品说明重悬微球悬液。
（2）取出25×106个微球，离心（≥4 000g）2min收集微球。
（3）移除上清液，用1ml 0.1M MES（pH 6.0）重悬微球，涡旋振荡混匀，超声处理约20s。
（4）将重悬的微球移至USA Scientific（ 1415-2500）或者Eppendorf Protein LoBind（ 022431081）微量离心管，离心（≥8 000g）1～2min。
（5）移除上清液。
（6）用DMSO配制80mM MPBH（28.3mg/ml）溶液。
（7）用0.1M MES（pH 6.0）稀释MPBH溶液至16mM（5.7mg/ml）。
（8）取250µl稀释的MPBH重悬微球，涡旋混匀。
（9）向微球悬液中加入100µl 20mg/ml EDC（用0.1M MES，pH 6.0配制，现配现用），涡旋混匀。
（10）室温旋转孵育1h。
（11）加入1ml 0.1M MES（pH 4.5），涡旋混匀。
（12）离心（≥8 000g）1-2min收集微球。
（13）移除上清液，用1ml 0.1M MES（pH 4.5）重悬微球，涡旋混匀。
（14）离心（≥8 000g）1～2min收集结合的微球。
（15）重复步骤（9）和步骤（10）。共洗2遍。
（16）用1ml 0.1M MES（pH 4.5）重悬MPBH修饰的微球，置于2～8℃，避光保存。
注意事项：
在整个操作过程中，微球应该避免长时间的光照。
多糖抗原也可以通过抗原或者微球表面修饰与羧基化的微球偶联。例如，三聚氯氰（cyanuric chloride）交联修饰的多聚-L-赖氨酸与标准的EDC介导的化合物偶联方法联用，可以将肺炎球菌血清型多糖偶联至微球表面的羧基基团（Pickering等，2002）。高碘酸钠氧化肺炎球菌多糖已经成功地偶联至ADH-功能性微球（Biagini等，2003）。DMTMM也可用于肺炎球菌多糖与羧基化微球的偶联（Schlottmann等，2006）。
（二）偶联确认
捕获试剂与微球偶联后应检测两者之间共价结合的效率（Luminex Corporation，2006c）。偶联抗体的效价可以通过PE标记的抗种属特异性抗体确定，而偶联抗原的滴度可以用标记的特异性抗体检测。下面举例说明抗体偶联确认的操作方案。该方案的洗涤步骤使用了真空抽滤装置；对MagPlex微球而言，洗涤可以选用磁分离法。值得注意的是，当使用真空过滤时，在抽真空的过程中不要让过滤器干燥，否则会导致微球粘在滤膜上。滤膜上的微球可以通过轻轻吹打重悬下来。MFI应随着标记的检测抗体的浓度增加而增加。通常情况下，抗体偶联在饱和时的MFI至少达到10 000才能在免疫学分析中取得最佳的效果（Luminex Corporation，2006g）。
抗体偶联的确认实验方案：
（1）选择合适的抗体偶联微球簇。
（2）涡旋混匀重悬微球，超声处理约20s。
（3）制备微球工作液：用试验缓冲液将偶联微球稀释至终浓度为每微升每套微球100个。每次反应需要50µl微球工作液。
（4）用试验缓冲液以倍比稀释法将PE标记的抗种属IgG抗体从4µg/ml稀释至0.062 5µg/ml。每次反应需要50µl稀释抗体。
（5）预湿滤膜孔径1.2µm的滤板（Millipore，MABVN1250）：每孔加入100µl试验缓冲液，用真空歧管吸出。
（6）每孔加入50µl微球工作液至滤板相应孔中。
（7）每孔加入50µl稀释的检测抗体至滤板对应孔中。
（8）用多通道移液器轻轻吹吸混匀。
（9）封板，在板式振动器上室温孵育30min。
（10）用真空歧管吸走上清液。
（11）用100µl试验缓冲液洗2遍，真空歧管吸干。
（12）加入100µl试验缓冲液重悬微球，用多通道移液器轻轻吹吸混匀5遍。
（13）取出50～75µl微球悬液在Luminex分析仪中进行检测。
注意事项：
① 在整个操作过程中，微球应该避免长时间的光照。
② 缓冲液的信息详见表2-7-1。
（三）方法学优化
确认微球成功偶联后，选择性能最优的试剂与标准品或质控品进行下一步检测。通常，选择重组蛋白或者已知的阴阳性标本，并采用合适的基质将其溶解以尽可能地使之与测试样品的成分一致。多重分析的优点是可以筛选候选的捕获试剂和检测试剂。例如，偶联针对一个待测物的几种不同捕获抗体先分别偶联至不同种微球，然后利用多重分析对各自候选的检测抗体及待测物进行检测，可以快速鉴定出针对该待测物的最佳捕获抗体和检测抗体。多克隆抗体和单克隆抗体都能用于检测，但是单克隆抗体作为检测抗体时与捕获抗体针对的是不同的抗原表位，或者它们是针对待测物上重复的相同表位。检测抗体通常是生物素化抗体，与链霉抗生物素蛋白 -R-藻红蛋白（SAPE）联用作为报告基团。检测抗体也可以直接标记PE，这样在分析时不需要再标记其他报告基团。一旦确定了最佳的抗体组合，偶联的微球微阵列应该与每一个分析物和每一个检测抗体进行测试，以评估检测性能和特异性。如果抗体与不同的待测物存在交叉反应，那么起初筛选鉴定的捕获抗体或检测抗体必须替换。
然后，用单个待测物和多重检测抗体测试多重分析微球的灵敏度，用不同检测抗体检测微球的干扰物。检测抗体的最佳浓度随所用试剂的变化而变化，其效价应该用滴定法确定（如倍比稀释从4µg/ml稀释至1µg/ml），但是通常情况下，2～4µg/ml的抗体浓度即已足量。与单一分析相比，多重分析由于不同的检测抗体之间会发生相互作用，因此检测抗体的浓度应该相应增加。同样，如果多重分析的通量数（测试项目数）增加，那么每种检测抗体所需的量也应该相应增加。在免洗的方法学测定中，检测抗体的浓度应该增加高至5倍，以中和上清液中过多的未结合的待测物。通常情况下，报告荧光基团（SAPE）的浓度应该是检测抗体的1.5～2倍。SAPE的浓度超过4µg/ml需要在标记后进行洗涤以降低背景，而终浓度超过8µg/ml可能会干扰分析仪的背景消除。
最后，由于多重分析中待测物和试剂种类众多，为了检测多重分析方法的灵敏度和抗干扰特性，必须进行全面和完善的多重分析法的性能验证。多重分析方法的研发是一个迭代过程，由于检测组分间相互作用复杂，优化试验需要不断重复。根据方法学的特异性，所有的试验条件都需要进行优化以达到最优设计结果，包括缓冲系统、封闭试剂、样本体积和稀释度、反应总体积、每个反应所需的微球数量（每孔每个区域2 000～5 000个微球）、偶联捕获试剂的浓度、检测抗体和报告基团的浓度、方法特点（洗涤或免洗）和孵育时间等。检测方法的性能需要用已知的标本来评估和验证。浓缩样品和组成非常复杂的样品至少1∶5稀释，如血清、血浆或者组织裂解物，以避免干扰或微球凝集，防止基质效应的产生。任何能够引起干扰、交叉反应或者效能不佳的试剂都应该被替换。
当开发多重分析方法时，应该考虑检测性能的优化、方法学的灵敏度、检测范围、操作简便性以及报告时间。为了提高灵敏度和增强检测信号强度，可使用多种信号放大技术，包括调整Luminex 100/200和FLEXMAP 3D分析仪的PMT设置、筛选SAPE报告基团的类别、选取树状大分子、滚环扩增技术和增加标记额外的报告基团等。减少微球和样本的初始孵育体积和/或增加初始的孵育时间，可以提高待测物的结合动力学，从而提高试验的灵敏度。虽然看似矛盾，但有些时候通过减少偶联至微球的捕获试剂可以提高试验灵敏度。尽管这可能会导致在待测物浓度很低的情况下就会出现饱和现象而降低信号峰值，但它可能会改善低浓度时的线性，因此提高检测限（图2-7-3（a））。无论是捕获抗体还是检测抗体，高亲和力的抗体也能提高检测灵敏度。当待测物浓度很高时，增加偶联至微球的捕获试剂的量，可以获得更高的检测信号和扩大检测范围（图2-7-3（a））。有时通过对不同颜色的微球偶联不同亲和力的捕获抗体，并将它们组合可建立多重分析的标准曲线，有助于提高检测灵敏度和扩大检测范围（图2-7-3（b））。将不同浓度的同一种抗体偶联至不同颜色的微球也能获得相同的效果。
将含有洗涤步骤的实验改为免洗的实验可以减少手工操作时间并减少总测定时间。如果改为免洗模式，那么可能需要减少样本体积和/或增加检测抗体和SAPE的浓度以中和反应体系中高浓度的未结合待测物和检测抗体。与含有洗涤步骤的方法相比，免洗法增加检测抗体和检测前稀释样本可以克服干扰物质引起的基质效应。在某些情况下，添加标记后的洗涤步骤可以减少背景信号和提高方法学的总体效能和灵敏度。
五、免疫检测构架
（一）免疫计量分析法
xMAP技术灵活性高，该系统与多种检测方法兼容，应用于其他平台的常用免疫检测方法也适用于Luminex分析仪。常用于ELISA的免疫计量分析法（或夹心捕获法）同样适用于xMAP平台，两者差别在于ELISA使用酶报告系统而xMAP平台使用的是固定且稳定的荧光报告系统。xMAP技术是将特异性捕获抗体共价包被在具有多重标记的微球上，微球与样品进行孵育（图2-7-4）。样品中各种待测物与对应的微球特异性结合，然后加入常用的生物素和链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白标记的特异性检测抗体，即可对待测物进行检测分析。实验过程是否需要洗涤取决于试验性能与时间需求、样本基质和所使用试剂的性质。洗涤可手工操作，也可通过真空抽滤或磁性分离（用MagPlex微球时）由自动洗板机来完成。目前已有一些应用Microplex或MagPlex微球的免疫测定法（夹心法）的操作步骤可供参考（Luminex Corporation，2006e，f，2007g）。对于需洗涤的（MagPlex微球法）和免洗的免疫分析方法，本节分别列举了具有代表性的操作步骤，具体如下。
1.使用MagPlex微球的免疫分析法（夹心法）的操作步骤
（1）选择合适的抗体偶联微球组合。
（2）涡旋震荡和超声约20s以重悬微球。
（3）配制微球工作液，用检测缓冲液将每组偶联的贮存微球稀释到终浓度为100个微球/µl，每个反应需要50µl微球工作液。
（4）分装微球工作液到圆底孔板的相应孔中反应（CoStar 3789），每孔50µl。
（5）空白孔加50µl检测缓冲液。
（6）加50µl标准品或样本至相应孔中。
（7）用排枪轻轻吹打反应液数次以混匀。
（8）反应封板，于摇床上室温孵育30min，转速约为800r/min。
（9）将反应板置于磁珠分离器上分离30～60s。
（10）用排枪小心地吸出上清液，注意不要吸到微球。
（11）将反应板置于分离器上继续进行以下步骤：
① 各孔加入100µl检测缓冲液；
② 使用排枪小心吸出各孔上清液，或使用手工倒置去除上清液，注意不要触到微球；
③ 重复上述步骤a和b。
（12）从磁性分离器上取下反应板，用排枪吸取50µl检测缓冲液重悬微球，轻轻吹打数次混匀。
图2-7-3 检测性能中微球的偶联效率
注：（a）偶联的捕获抗体越少，MFI越低但是灵敏度越高，偶联抗体越多，MFI越高，动态范围越宽；（b）用不同亲和力的捕获抗体偶联不同的微球簇用于制作多重分析的标准曲线，它的灵敏度很高，检测范围很宽
（13）用检测缓冲液稀释生物素化检测抗体到4µg /ml，每个反应需要稀释后的检测抗体50µl。
（14）在各孔中加入50µl稀释后的检测抗体。
（15）用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
（16）反应封板，于摇床上室温孵育30min，转速约为800r/min。
（17）将反应板置于磁性分离器中，30～60s内完成分离。
（18）用排枪小心吸出各孔上清，或手工倒置去除上清液，注意不要触到微球。
（19）将反应板置于分离器上继续进行以下步骤：
① 各孔加100µl检测缓冲液；
② 用排枪小心吸出各孔上清液，或手工倒置去除上清液，注意不要触到微球；
③ 重复上述步骤a和b。
（20）从磁性分离器上取下反应板，用排枪吸取50µl检测缓冲液重悬微球，轻轻吹打数次混匀。
（21）用检测缓冲液稀释SAPE到4µg /ml，每个反应需要稀释后的SAPE 50µl。
图2-7-4 免疫计量分析法（夹心法）
注：样品中的待测物与抗体偶联的微球相结合。待测物被捕获到相应的微球上，与荧光标记的检测抗体结合形成夹心复合物，通过荧光定量检测待测物含量
（22）加入50µl稀释后的SAPE到各孔中。
（23）用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
（24）反应封板，于摇床上室温孵育30min，转速约为800r/min。
（25）将反应板置于磁性分离器中，30～60s内完成分离。
（26）用排枪小心吸出各孔上清液，注意不要触到微球。
（27）将反应板置于分离器上继续进行以下步骤：
① 各孔加入100µl检测缓冲液；
② 用排枪小心吸出各孔上清液，或人工倒置去除上清液，注意不要触到微球；
③ 重复上述步骤a和b。
（28）从磁性分离器上取下反应板，用排枪吸取100µl检测缓冲液重悬微球，轻轻吹打数次混。
（29）按系统操作手册，取50～75µl样品于Luminex分析仪中检测。
注意事项：
① 在操作过程中避免微球在光线中长时间暴露；
② 缓冲液信息见表2-7-1；
③ 磁性分选器信息见表2-7-2。
2.免洗免疫分析法（夹心法）的操作步骤
（1）选择合适抗体偶联的微球组合。
（2）涡旋振荡和超声混匀约20s以重悬微球。
（3）配制微球工作液，用检测缓冲液将偶联的微球稀释到终浓度为200个/µl，每个反应需要25µl微球工作液。
（4）分装微球工作液到圆底反应板相应的孔中（CoStar 3789），每孔25µl。
（5）加入25µl检测缓冲液至空白孔中。
（6）加入25µl标准品或样本至相应的孔中。
（7）用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
（8）封板，于摇床上室温孵育30min（非磁性微球时转速约为400r/min，MagPlex微球时转速约为800r/min）。
（9）用检测缓冲液稀释生物素化的检测抗体到合适的浓度，每个反应需要稀释后的检测抗体25µl。
（10）每孔加入稀释后的检测抗体25µl。
（11）用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
（12）封板，于摇床上室温孵育30min（非磁性微球时转速约为400r/min，MagPlex微球时转速约为800r/min）。
（13）用检测缓冲液稀释SAPE到合适的浓度（一般≥4µg/ml），每个反应需要稀释后的SAPE 25µl。
（14）加25µl稀释后的SAPE到各孔中。
（15）用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
（16）封板，室温下在摇床上孵育30min（非磁性微球时转速约为400r/min，MagPlex微球时转速约为800r/min）。
（17）按系统操作手册，取50～75µl样品于Luminex分析仪中检测。
注意事项：
① 在操作过程中避免微球在光线中长时间暴露；
② 缓冲液信息见表2-7-1；
③ 检测抗体和SAPE浓度应优化至最佳浓度，最佳浓度一般高于洗涤法中的浓度；
④ 如果背景较高，则需在分析前增加一次标记后的洗涤步骤。洗涤方法参考真空过滤或磁性分离洗涤法。
（二）间接免疫分析法
xMAP技术也可应用于间接（血清学）免疫分析法，即待测样品中特异性抗体通过与微球表面偶联的抗原结合而被检测（图2-7-5）。如前文所述，抗原的偶联可通过多种化合物来实现。偶联抗原的最佳浓度取决于抗原分子大小，其应通过滴定法进行确定，但是在血清学检测中，通常以0.04～5µg/100万个微球为宜。利用标记的抗种属特异性的检测抗体（二抗）来检测微球表面捕获的抗原特异性抗体（一抗）。抗种属特异性检测抗体通常用PE荧光报告基团直接标记或用生物素-SAPE标记。血清学免疫检测通常需要洗涤，以去除未结合的抗体和其他复杂基质蛋白，以免引起干扰和增加背景信号（Luminex Corporation，2006d，2011c）。使用Mag-Plex微球和磁性分离器可以简化清洗步骤。下面详细介绍应用MagPlex微球的间接免疫测定法的操作步骤。
图2-7-5 间接免疫分析法
注：将含有抗原特异的抗体的样品与抗原偶联的微球结合。抗体被相应微球捕获，然后通过定量结合荧光标记的抗种属检测抗体进行检测
间接（抗体捕获）免疫分析法操作步骤
1.选择合适的抗原偶联的微球阵列。
2.涡旋振荡和超声混匀约20s以重悬微球。
3.配制微球工作液，用检测缓冲液将偶联的微球稀释到终浓度为100个微球/µl，每个反应需要50µl微球工作液。
4.分装微球工作液到圆底反应板（CoStar 3789），每孔50µl。
5.加50µl检测缓冲液到各空白孔中。
6.加50µl标准品或样本到相应分析孔中。
7.用排枪轻轻吹打数次以混匀。
8.封板，并在室温下于摇床上孵育30～60min（MagPlex微球时转速约为800r/min）。
9.将反应板置于磁性分离器上30～60s。
10.用排枪小心吸出各孔上清液，注意不要触到微球。
11.将反应板置于分离器中继续以下步骤：
（1）加100µl检测缓冲液到各孔中；
（2）使用排枪小心吸出各孔上清液，或手工倒置去除上清液，注意不要触到微球；
（3）重复上述步骤a和b。
12.从磁性分离器上取下反应板，用排枪吸取50µl检测缓冲液重悬微球，轻轻吹打数次混匀。
13.用检测缓冲液稀释PE标记的抗种属IgG检测抗体浓度至4µg/ml，每个反应需要稀释后的检测抗体50µl。
14.加50µl稀释后的检测抗体到各孔中。
15.用排枪轻轻吹打数次以混匀。
16.封板，室温下于摇床上孵育30min（MagPlex微球时转速约为800r/min）。
17.将反应板置于磁性分离器上30～60s。
18.用排枪小心吸出各孔上清液，注意不要触到微球。
19.将反应板置于磁性分离器上继续以下步骤。
（1）加100µl检测缓冲液到各孔中；
（2）使用排枪小心吸出各孔上清液，或人工倒置去除上清液，注意不要触到微球；
（3）重复上述步骤a和b。
20.从磁性分离器上取下反应板，用排枪吸取100µl检测缓冲液重悬微球，轻轻吹打数次混匀。
21.按系统操作手册，取50～75µl样品于Luminex分析仪中检测。
注意事项：
（1）在操作过程中避免微球在光线中长时间暴露；
（2）缓冲液信息见表2-7-1；
（3）磁性分离器信息见表2-7-2。
（三）竞争免疫分析法
竞争免疫分析法特别适用于小分子待测物检测，这些小分子仅含有一个或几个抗原表位，可获得的抗体也仅有一种或几种。该方法中由于存在竞争性分析物，MFI信号随着待测物浓度的增加而降低。图2-7-6显示的是xMAP技术平台的两种竞争免疫分析法。模式1：将待测物特异的抗体偶联到微球表面，样品中的待测物与试剂中标记的待测物会竞争结合微球表面偶联的抗体。模式2：微球表面偶联的待测物，与样本中的待测物竞争结合标记的检测抗体（模式2）。对于这两种模式，标记的检测试剂的浓度应达到最大信号强度的70%～80%（［IC70］或［IC80］），以避免结合达到饱和状态，并且确保在标准曲线的最陡部分进行测量。 ［IC70］或［IC80］的测定是通过在没有样品的情况下用微球偶联的标记检测试剂来滴定完成的。以下介绍两种模式（免洗涤）的操作步骤，两种模式的主要差别是加入试剂的顺序不一样（Luminex Corporation，2006b，2007d）。
图2-7-6 竞争免疫分析法
注：（a）模式1中，样品中的分析物与标记的分析物竞争结合特定抗体偶联的微球；（b）模式2中，样品中的分析物与分析物偶联的微球竞争结合标记的检测抗体
1.微球偶联抗体的竞争免疫分析法操作步骤
（1）选择合适的抗体偶联的微球阵列。
（2）涡旋和超声混匀20s以重悬微球。
（3）配制微球工作液，用检测缓冲液将偶联的微球稀释到终浓度为200个微球/µl，每个反应孔需要加入25µl的微球工作液。
（4）用检测缓冲液将生物素化的竞争抗原试剂稀释到 ［IC70］或［IC80］，每个反应需要25µl稀释后的生物素化的竞争抗原试剂。
（5）加25µl检测缓冲液到圆底反应板（CoStar3789）的各空白孔中。
（6）在相应孔中加25µl标准品或样本。
（7）每孔中加入25µl稀释后的生物素化竞争抗原。
（8）用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
（9）各孔加25µl微球工作液。
（10）用排枪轻轻吹打反应液数次以混匀。
（11）封板，室温下在平板摇床上孵育30min（非磁性微球时转速约为400r/min，MagPlex微球时转速约为800r/min）。
（12）用检测缓冲液稀释SAPE到适当的浓度（通常≥4µg/ml），每个反应需要25µl稀释后的SAPE。
（13）每孔中加25µl稀释的SAPE。
（14）用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
（15）封板，室温下在平板摇床上孵育30min（非磁性微球时转速约为400r/min，MagPlex微球时转速约为800r/min）。
（16）按系统操作手册，取50～75µl样品于Luminex分析仪中检测。
注意事项：
① 在操作过程中避免微球在光线中长时间暴露。
② 缓冲液信息见表2-7-1。
③ ［IC70］和［IC80］分别指获取最大捕获信号强度的70%和80%的生物素化竞争性抗原的浓度，［IC70］和［IC80］需要用检测缓冲液滴定来确定。
④ SAPE浓度应优化至最佳浓度，最佳浓度一般高于洗涤法中的浓度。
⑤ 如果背景较高，则需在分析前增加一次洗涤的步骤，可参考洗涤检测方法中真空过滤或磁性分离洗涤法的步骤。
2.微球偶联抗原的竞争免疫分析法操作步骤
（1）选择合适的抗原偶联的微球阵列。
（2）涡旋振荡和超声混匀20s以重悬微球。
（3）配制微球工作液，用检测缓冲液将偶联的微球稀释到终浓度为200个微球/µl，每个反应需要25µl微球工作液。
（4）用检测缓冲液将生物素化的检测抗体稀释到 ［IC70］或［IC80］，每个反应需要25µl稀释后的生物素化的检测抗体。
（5）加25µl检测缓冲液到圆底反应板（CoStar3789）各空白孔。
（6）在相应孔中加25µl标准品或样本。
（7）每孔加25µl微球工作液。
（8）用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
（9）每孔加25µl生物素化的检测抗体。
（10）用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
（11）封板，室温下在平板摇床上孵育60min（非磁性微球时转速约为400r/min，MagPlex微球时转速约为800r/min）。
（12）用检测缓冲液稀释SAPE到适当的浓度（通常≥4µg /ml），每个反应需要25µl稀释后的SAPE。
（13）每孔加25µl稀释的SAPE。
（14）用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
（15）封板，室温下在平板摇床上孵育30min（非磁性微球时转速约为400r/min，MagPlex微球时转速约为800r/min）。
（16）按系统操作手册，取50～75µl样品于Luminex分析仪中检测。
注意事项：
① 在操作过程中避免微球在光线中长时间暴露。
② 缓冲液信息见表2-7-1。
③ ［IC70］和［IC80］分别指获取最大捕获信号强度的70%和80%的检测抗体的浓度，［IC70］和［IC80］需要用检测缓冲液滴定来确定。
④ 检测抗体和SAPE的浓度应优化至最佳浓度，最佳浓度一般应高于洗涤法中的浓度。
⑤ 如果背景很高，则需在分析前增加一次洗涤的步骤，可参考经洗涤法中真空过滤或磁性分离洗涤法的步骤。
（四）直接免疫测定和竞争免疫分析法的联合应用
竞争免疫分析法也可与免疫计量分析法（夹心法）联用进行多重分析（Luminex Corporation，2006a）。这个联合应用策略（免洗）的操作步骤如下。
直接免疫测定法和竞争抑制免疫分析法联用操作步骤
1.选择合适的抗体和（或）抗原偶联的微球试剂。
2.涡旋振荡和超声混匀20s以重悬微球。
3.配制微球工作液，用检测缓冲液将偶联的微球稀释到终浓度为1 000个微球/µl，每个反应需要5µl微球工作液。
4.用检测缓冲液将生物素化的竞争物稀释到 ［IC70］或［IC80］，每个反应需要5µl稀释后的生物素化的竞争物。
5.加10µl检测缓冲液到圆底反应板（CoStar 3789）的各空白孔中。
6.在相应孔中加入10µl标准品或样本。
7.每孔加5µl稀释的竞争物。
8.用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
9.每孔加入5µl微球工作液。
10.用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
11.封板，室温下在平板摇床上孵育60min（非磁性微球时转速约为400r/min，MagPlex微球时转速约为800r/min）。
12.用检测缓冲液将生物素化的检测抗体稀释到适当的浓度，每个反应需要10µl稀释后的生物素化检测抗体。
13.每孔加入10µl稀释的检测抗体。
14.用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
15.封板，室温下在平板摇床上孵育60min（非磁性微球时转速约为400r/min，MagPlex微球时转速约为800r/min）。
16.用检测缓冲液稀释SAPE到适当的浓度（通常≥10-12µg /ml），每个反应需要10µl稀释的SAPE。
17.各孔加入10µl稀释的SAPE。
18.用排枪轻轻吹打反应物数次以混匀。
19.封板，室温下在平板摇床上孵育30min（非磁性微球时转速约为400r/min，MagPlex微球时转速约为800r/min）。
20.每孔中加入检测缓冲液至终体积为100µl。
21.按系统操作手册，取50～75µl样品于Luminex分析仪中检测。
注意事项：
（1）在操作过程中避免微球在光线中长时间暴露。
（2）缓冲液信息见表2-7-1。
（3）［IC70］和［IC80］分别指获取最大捕获信号强度的70%和80%时的检测抗体的浓度，［IC70］和［IC80］需要用检测缓冲液滴定来确定。
（4）生物素化的竞争物、检测抗体和SAPE的浓度应优化至最佳浓度，最佳浓度一般应高于洗涤法中的浓度。
（5）如果背景很高，则需在分析前增加一次洗涤的步骤。可参考经洗涤的检测方法中真空过滤或磁性分离洗涤法的步骤。
六、商品化免疫检测应用和检测平台
xMAP技术的广泛应用促进了一系列科研产品和平台的开发，并获准用于免疫诊断实验室的体外诊断。这些产品包括人类白细胞抗原（HLA）和组织配型的蛋白和抗体检测、自身免疫性疾病分析、感染性疾病的血清学检测、神经退行性变以及过敏原筛查（Luminex Corporation，2011a）。表2-7-3介绍了Luminex合作伙伴提供的各种免疫诊断平台、应用领域和相关服务。列出的参考文献是最近（2013年，译者注）发表的论文，这些论文描述了相关产品在免疫诊断中的应用和性能。
七、结语
Luminex xMAP 系统可在一个反应体系中同时检测多达500种待测物，通量高，性能佳。xMAP技术所需仪器、实验方法学和软件容易获得，因此广泛用于免疫诊断、临床前期试验/临床试验以及研究领域，是一种快速、经济、高通量的生物检测平台。同时，涉及该方法的实验方案和出版物也容易获得，进一步促进了该技术的发展和推广应用。目前，已发表的文献也证明了该技术平台的灵活性和通用性。虽然本章节主要介绍xMAP技术的免疫检测方法、诊断应用及相关产品，但是该技术同样广泛应用于核酸检测，包括单核苷酸多态性基因分析、分子遗传学、基因表达谱、传染性疾病的分子检测和microRNA表达谱分析等。
表2-7-3 xMAP免疫诊断应用和平台
续表
八、参考文献和进一步阅读
（黄宪章、郑磊 译，陈福祥 审）