第五节　细胞冻存复苏技术

利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏细胞用于实验。适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。标准冷冻速度开始为-2～-1℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。

一、细胞冻存的步骤

1.选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理，然后将细胞收集于离心管中离心（1 000rpm，10min）。

2.弃去上清液，加入含20%血清的完全培养基，于4℃预冷15min后，逐滴加入已无菌的DMSO（使加入DMSO占培养基的5%～15%，一般7.5%和10%常用），用吸管轻轻吹打使细胞均匀，也可以先配好含有DMSO的培养基然后用该培养基重悬需要冻存的细胞，细胞浓度为5×10⁶～1×10⁷个 /mL。

3.将上述细胞悬液分装至2mL冻存管中，每管0.25mL。将冻存管盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时做好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。

4.将装好细胞的冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜。如果有程序降温器最好（放在-80℃冰箱过夜，放入液氮罐）；或者可以在4℃放置2h，然后转到-20℃放置2h，-80℃放置2h或过夜，最后放入液氮罐。

二、细胞复苏的步骤

1.从液氮容器中取出冻存管，注意佩戴护目镜，立刻浸入37℃温水中，轻微摇晃，并不时摇动令其尽快融化。

2.即将完全融化时，打开冻存管盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍体积以上的已复温培养基，混匀。

3.常温1 000rpm、5min离心。

4.弃去上清液，加入含10%血清培养液重悬细胞，调整细胞数目，37℃培养箱静置培养，翌日换液。

复苏的注意事项：在解冻冻存细胞后，会出现存活率低、大量细胞碎片及生长缓慢等问题，可能的原因之一是没有做到快速复苏细胞。

三、冻存复苏出现的问题与对策

（一）细胞复苏后存活率低

冻存细胞复苏后的存活率为50%～80%，导致细胞低存活率的因素有多方面，表2-5列出了详细的原因与对策。

（二）细胞冻存后形态变化

低温保护剂可保护细胞不受冰冻影响，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等渗透型低温保护剂，其作用机制包括：自由进入细胞，取代水，使冰点下降，充当盐的二次溶剂，提高细胞膜对水的通透性。然而，部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，但也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。因此，标准的自制冻存液会含有血清，因为血清可以降低细胞毒性。尽管大多数研究和医学领域都存在优化的冷冻保存方案和已发表的配方，但依然会遇到细胞冻存后形态发生变化的问题，其原因与对策详见表2-6。

（三）细胞冻存后丢失

由于细胞冷冻保存在液氮环境中，冻存的细胞在取用过程中容易发生以下问题导致细胞丢失。第一，液氮浸入冻存管内，复温的过程容易发生冻存管炸裂的现象；第二，储存架、样本盒以及冻存管标记不当，导致种子细胞被转移；第三，细胞储备耗尽。上述问题对策详见表2-7。