第六节　细胞培养防污染技术

体外培养的细胞受到严重污染时，有时即使想尽各种办法也难以挽回。因此，防止污染，预防是关键。只有将预防措施贯穿于整个细胞培养的操作环节中，才能将发生污染的可能性降到最小。

一、细胞污染

（一）实验室常见的细胞污染

1.细菌污染

细菌污染是细胞培养中最常见的污染，需要重视并预防污染，否则不仅浪费时间，而且消耗人力、物力，造成不必要的损失。细菌污染细胞后，肉眼可观察到培养液变混浊、pH改变，进而导致培养基颜色改变，显微镜下观察细胞杂质增多（图2-2A）。受污染的细胞会出现病理性改变，例如胞内颗粒增多、增粗，甚至变圆脱落死亡。目前，污染细胞最常见的细菌有革兰氏阳性杆菌、白色葡萄球菌等。

2.真菌污染

培养细胞被真菌污染后，肉眼可观察到培养液漂浮或散在生长白色或浅黄色的小点，显微镜下可观察到丝状、管状的菌丝纵横交错在培养基中（图2-2B）。真菌污染后，细胞生长变缓慢，最后以营养耗竭及毒性作用导致细胞脱落死亡。目前，污染细胞最常见的真菌有烟曲霉菌、黑曲菌、毛霉菌、白念珠菌和酵母菌等。

3.支原体污染

支原体是最小、最简单的原核生物，基因组为环状双链DNA，大小为0.1～0.3µm。支原体多呈球形，没有细胞壁，对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。目前，全球估计15%～35%细胞培养中受到支原体污染，在部分国家甚至达到80%。40%的培养细胞进行高通量测序（NGS）都能获得支原体的序列。支原体来源甚广，可以被污染的细胞系、血清、培养基或者实验室人员不小心操作引入培养体系。支原体污染的细胞生长似乎正常，但细胞状态变差、生长变慢、冻存后难以复苏，并且影响测序结果、实验结果难以重复或者与报道的不相符。污染严重时甚至导致细胞突然死亡。当发生支原体污染时，每个细胞可能有数百个支原体黏附在细胞膜上或者侵入细胞，进行繁殖与宿主争夺养分，能改变宿主DNA、RNA、蛋白质合成，导致细胞表型发生改变，如细胞死亡、染色体畸变、核酸合成障碍、抑制生长、代谢紊乱、细胞膜表面抗原改变等（图2-2C）。

（二）造成细胞污染的可能原因

1.为了方便、省时间，超净台使用超过3h仍不开紫外灯灭菌，或者灭菌时间不足30min，酒精擦拭后直接开始试验。

2.长时间放置又未被使用的器材或溶液，使用之前应该检测是否被污染；离心管应该一次性使用，多次使用容易造成污染；枪头如果交叉使用容易造成携带污染。

3.实验过程未佩戴手套以及口罩，徒手操作容易把手上的细菌带入实验材料中。

4.细胞培养间配备枪式移液器、手术器械、离心机、冰箱等专用仪器设备以及专用的实验服和拖鞋，未定期消毒；专用物品被带出细胞房使用；培养箱长时间没清洁。

（三）细胞污染后的处理

当发现有污染的痕迹时，需要警惕并及时处理。可以在电子显微镜下观察，或通过微生物培养法检测，也可以选择DNA染色、PCR、ELISA或者专业的试剂盒检测。

在细胞培养的过程中，要使用无菌产品。血清、培养基要查看其支原体检测指标；其他试剂，若不是细胞级别的，未进行过滤处理的要进行超滤。同时要定期清理细胞房、水盘、水浴锅、培养箱。初次操作人员需要先进行相关培训，实操时要谨记各种注意事项。如果有需要，也可以预防性使用抗生素。当通过检测发现污染时，可以选择扔掉。如果细胞不可替代，可以使用试剂盒特异性地清除培养基中的支原体。

二、防止细胞污染的措施

1.添加抗生素

对细胞本身也有一定影响，因此为避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素处理。

2.物品、用品的消毒灭菌

75%的酒精擦拭培养箱后，使用可移动的紫外灯至少消毒30min，在培养箱水槽中加入高压灭菌的超纯水保持湿度。

3.避免细胞交叉污染

所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞备用。重要细胞系（株）的传代工作应由两人独立进行。

（何国东　蔡 轶）