第六节 基因毒性杂质的检查
基因毒性杂质（Genotoxic Impurity，GTI）是指那些在体内外试验中，能够对DNA具有直接或间接破坏性，产生基因突变或体内诱变，而具有致癌可能或者倾向的杂质。基因毒性也称为遗传毒性。潜在基因毒性的杂质（Potential Genotoxic Impurity，PGI）是指在化学结构上与基因毒性杂质相似的杂质，具有警示性；但是，未经试验证明。黄曲霉毒素类、亚硝胺类和甲基磺酸酯等化合物，均为常见的基因毒性杂质。大多数化疗药物也具有一定的基因毒性，如顺铂、卡铂、氟尿嘧啶等，它们的不良反应主要是由于这些化疗药物对正常细胞的基因毒性引起。
基因毒性杂质的毒性很强，常常在很低的含量或浓度水平下，即可对人体造成遗传物质损伤，并进而导致基因突变促使肿瘤发生。所以，如果在药物中有残留，将对用药安全造成极大的威胁。例如，抗白血病药物甲磺酸伊马替尼，因其原生成工艺使用乙醇重结晶，若残留的乙醇与药物中成盐的甲磺酸反应，则易生成基因毒性杂质甲磺酸乙酯，若其严重超标，会给患者带来严重的遗传毒性风险。
对于原料药和制剂中的基因毒性杂质，一方面，可以通过改变合成或纯化路线，避免基因毒性杂质的生成，或最大限度地去除相关杂质；另一方面，进一步表征遗传毒性和致癌性风险，以更好地支持适当的杂质限度指标（上限值或下限值）。
一、基因毒性杂质的限度
如果基因毒性杂质的生成不可避免，或者不能完全去除，可以通过风险评估，比如估算 “每日最大暴露量”值，低于该暴露量时就可以忽略其对人体健康的风险。
ICH使用毒理学关注阈值（Threshold of Toxicological Concern，TTC，毒性杂质限度）控制遗传毒性杂质。TTC表示基因毒性杂质不引起显著致癌性或其他毒性作用的暴露阈值水平。除了少数强遗传毒性化合物（如黄曲霉毒素类、N-亚硝基物和偶氮类化合物等）外，绝大多数化合物的TTC均设定为每日摄入量1.5μg。该阈值相当于增加了十万分之一的患癌风险，与药物带来的明显益处相比，显然是合理可接受的极低水平风险。
依据遗传毒性研究，对于预期用药时间较短，或用于威胁生命疾病的治疗，或患者的预期存活期少于5年，也可以接受TTC值高于1.5μg/d的设定。通常TTC值与暴露时间的相关性如表3-6所示。
表3-6 单一基因毒性杂质暴露时间与阈值水平的关联设置
TTC值为1.5μg/d是针对不同结构基因毒性单一杂质的限度。对于结构相同或者相似的基因毒性杂质，其总量应不超过1.5μg/d。
二、基因毒性杂质的分析策略
基因毒性杂质通常根据基因毒性（突变性）和致癌性程度进行分类和可接受限度标准的研究与制定。
但是，由于杂质的结构多种多样，对于绝大多数杂质而言，往往没有充分的基因毒性或致癌性研究数据，因而难以对其进行归类。在缺乏安全性数据支持的情况下，通常采用“警示结构”作为区分普通杂质和基因毒性杂质的标志，如表3-7所示。
当杂质不含有表3-7中“警示结构”时，一般可以不作为基因毒性杂质研究。当一个杂质含有“警示结构”，但致突变试验结果为阴性时，也不需要特别关注。对于潜在的基因毒性杂质，除非它属于具有非常强基因毒性的物质（如N-亚硝基化合物、偶氮化合物或黄曲霉毒素类化合物等），如果控制其含量在TTC值的水平时，就不强制要求进行基因毒性的常规检测。
制定API中的基因毒性杂质的限度时，可根据TTC和API的日给药量进行计算。例如抗白血病药物甲磺酸伊马替尼，其合成工艺路线可导致甲磺酸酯类基因毒性杂质的产生，根据其日最大给药剂量达800mg，按照TTC值1.5μg/d计算，制定基因毒性杂质甲磺酸酯类（甲酯、乙酯和异丙酯）的总限度为1.9ppm。在基因毒性杂质的检测手段方面，鉴于限度的要求，通常对100～1000ppm的杂质可以采用紫外或荧光检测，而1～100ppm的杂质检测常常需使用色谱-质谱联用等技术。
表3-7 具有基因毒性警示结构的有机化合物
示例3-31 甲磺酸伊马替尼中潜在甲磺酸酯类（甲酯、乙酯和异丙酯）基因毒性杂质检查
参考EP9通则中的碘化钠衍生化法，将磺酸酯类杂质全部衍生化为相应的挥发性碘代烷后进行GC-ECD测定。以80%乙腈为溶剂配制甲磺酸伊马替尼40mg/mL供试品溶液，每个甲磺酸酯的限度对照均设为1ppm进行检查，则每个甲磺酸酯的限度标准溶液浓度均为40ng/mL。
操作方法：取甲磺酸伊马替尼供试品约40mg，精密称定，置于10mL顶空瓶内，精密加入甲磺酸丁基酯内标工作液（40ng/mL，以80%乙腈为溶剂）1mL以及NaI溶液（称取无水硫代硫酸钠约50mg，精密称定，置于50mL容量瓶，加少量水溶解。称取NaI约60g，精密称定后，分批加入到容量瓶中，加水适当超声溶解并定容至刻度，摇匀，制得每1mL约含NaI为1.2g的水溶液，室温保存）1mL，立刻用惰性胶塞封口，扣紧顶空瓶盖，作为添加内标的供试品溶液。再精密吸取甲磺酸酯（甲酯、乙酯和异丙酯）基因毒性杂质混合标准溶液（浓度均为40ng/mL）1mL于10mL顶空瓶内，再精密加入NaI溶液1mL，用惰性胶塞封口，扣紧顶空瓶盖，作为基因毒性杂质限度检查的对照溶液。分别照顶空气相色谱法测定，以DB624（30m×0.53mm×3μm）色谱柱，N2载气线流速2mL/min，程序升温，起始温度为50℃，保持5min，然后以每分钟50℃的速率升温至200℃，保持2min，再温升到240℃，保持6min；顶空进样瓶加热温度60℃，加热平衡时间30min，定量阀温度80℃，传输管温度120℃；电子捕获检测器，温度为260℃，N2尾吹气流量30mL/min。进样口温度为200℃，分流比5∶1。顶空进样1mL，注入气相色谱仪，记录色谱图。
测定结果：空气和溶剂空白对于甲磺酸甲酯的检查略有干扰，但是不影响限度的检查。供试品中磺酸酯类基因毒性杂质（图3-19）均不超过限度要求。
图3-19 甲磺酸伊马替尼中对甲苯磺酸酯类基因毒性杂质的GC-ECD检查图
a—空白溶剂；b—未添加内标的供试品；c—混合限度对照；d—添加限度对照的供试品中
甲磺酸甲酯、乙酯、异丙酯和丁酯（浓度均为40ng/mL）衍生物的tR
分别为6.1min、7.4min、8.0min和9.4min