第一节 原料药的结构确证
原料药的结构确证系指确认所制备原料药的化学结构是否正确。结构确证是保证原料药及其制剂的药学研究、药理毒理试验和临床研究顺利进行的物质基础和决定性因素。
一、药物结构确证的一般过程
为完成原料药的结构确证研究,必须了解结构确证的基本规律,熟悉化合物鉴定的一般过程,并设计出符合目标化合物结构确证的研究方案,然后才能够实施有效的结构确证。
药物结构确证的一般过程,首先,应根据药物的结构特征,制定科学、合理、可行的研究方案;其次,制备符合鉴定要求的供试样品;然后,进行有机光谱分析,鉴定特征官能团和骨架结构特征;最后,综合解析确证供试品的结构。药物结构确证的一般过程如图4-1所示。
图4-1 药物结构确证的一般过程
1.药物结构确证常用方法
药物结构确证常用的光谱等测定方法包括:
① 用于分子式/分子量和结构单元测定的质谱(MS)或元素分析法;
② 用于官能团和指纹鉴定的红外吸收光谱(IR);
③ 用于结构中共轭体系识别的紫外-可见吸收光谱(UV);
④ 用于分子骨架结构鉴定的核磁共振谱(NMR);
⑤ 用于分子绝对结构直接测定的单晶X-射线衍射(SCXRD);
⑥ 用于粉末晶型特征分析的X-射线粉末衍射(PXRD);
⑦ 用于手性化合物旋光特征鉴定的圆二色谱(CD)和比旋度([α]);
⑧ 用于药物受热随温度变化特性测定的热分析法(DSC、TG)等。
2.药物的理化常数
药物结构确证的基础源于药物的基本结构,而基本结构决定了化合物的理化性质,表现出各自的特征理化常数,如溶解度、酸碱度、熔点、沸点、比旋度、吸光系数等。理化常数的测定通常均根据药典通则中的技术要求或相关方法原理进行。
在药物的结构鉴定中,必要的理化常数测定是进一步研究的基础。对于已有文献报道的药物,将其物理常数的测试结果与文献报道值比较,对药物的结构确证亦是有力的支持。
3.样品的要求
在药物结构确证研究中,为了获取准确的结构信息,减少杂质干扰,测试样品的纯度需要进行严格控制。
供试品纯度通常均依照其质量标准中的“有关物质”检查法(主要为HPLC-DAD)进行控制。通常供试样品的纯度应大于99.0%,纯度越高越好;杂质含量应小于0.5%。只有使用符合要求的供试品进行结构研究,才能获得正确的药物结构信息。所以,样品的精制是结构确证的关键步骤。一般应采用原料药制备工艺中的精制方法,对供试品进行进一步精制。
二、药物确证的基本内容
1. 研究方案的制定
药物结构千差万别,制备(获得)方法也各不相同,应根据药物的自身结构特征和制备(获得)方法制定出合理、可行的结构确证方案,才能有效地进行药物结构的确证研究。常见不同类型药物结构确证的测试方案如下。
(1)一般药物
一般药物是指结构相对简单,潜在干扰因素较少,通过常规光谱分析检测手段即可以确证结构特征的药物。
一般药物的结构确证方案:使用元素分析(必要时增加高分辨质谱)、MS、IR、UV、NMR、热分析(TG和DSC)和PXRD等进行测定和解析。对于存在顺反异构的化合物需特别阐明,必要时增加顺反异构的检测方法证明。
(2)特殊药物
与一般药物相比,特殊药物则指手性结构药物、有机盐及复合物或络合物、半合成药物、多晶型药物、含结晶水或结晶溶剂药物、多组分药物、多肽或多糖药物等。
特殊药物的结构确证:除进行一般药物结构确证的各项检测外,还应针对结构的特殊性,增加更为专属的检测方法,测定并表征药物结构的特殊点。
① 手性药物 手性药物包括单一手性药物、多中心手性药物、立体异构混合体药物、外消旋体或富集对映体药物。
针对手性结构特征鉴定的常用方法包括:比旋度测定、手性柱色谱、单晶X-衍射、旋光色散和圆二色谱等。
单晶X-衍射可提供最直接的立体结构特征信息。根据已知的起始原料构型、化学合成方法的立体选择性以及中间体的结构,可间接鉴定终产品药物的立体构型。
包含多中心手性的药物可能存在多种立体异构体。除上述手性研究外,还应就其绝对构型以及对映体的纯度加以研究,可提供更多的信息。
对于立体异构混合药物,如构型不同可引起明显的药理或毒理差异,应在明确手性的基础上,通过手性色谱分离定量阐明混合物之间的比例。
对于外消旋或富集对映体药物,可进一步通过比旋度的测定或手性色谱分离等方法,确定对映体的比例。
② 不含金属的有机盐或复合物 不含金属的有机盐或复合物药物的结构中酸碱结合强度一般相对较弱。根据结构确证的需要,可测定成盐前后的两套波谱和实验数据,经过比较分析,充分证明药物结构中的酸碱结合比例和状态。即使测定困难或不易说明药物结构中的成盐或复合状态,也应针对酸根或碱基进行波谱测定,并结合其他的实验,进行充分的确证。
③ 金属盐类和络合物 金属盐类和络合物药物,应对金属元素的种类、存在形式和含量进行针对性的确证实验。如果针对金属盐本身的测试不适宜,则应对成盐前的酸或配位体分子进行佐证性测试比较。
④ 半合成药物 如果合成用原料的母核结构已知,并且能够充分证明原分子的母核结构在半合成全程中未发生改变,则可适当简化对终产物母核部分的结构确认,仅对新引入基团的结构进行确证。也就是说,半合成药物或中间体等结构信息,可作为原料药结构确证的补充证据。
⑤ 多晶型药物 药物的不同晶型有可能引起理化性质(溶解性或稳定性等)甚至药理药效行为(生物利用度或活性等)的差异。所以,对多晶型药物进行晶型分析、比较研究和处方工艺设计,是药物质量和临床安全有效的有力保障。
采用具有晶型区分度的测试方法,进行药物不同晶型的测试和数据分析比较。药物晶型测定常用方法为粉末X-衍射(PXRD)、熔点、热分析、光学显微镜和红外吸收光谱等。
创新药物应进行药物在不同结晶条件下(溶剂、温度、结晶速度等)是否存在多晶型的研究。存在多晶型的仿制药物,应明确制备晶型的类型和纯度,在无药理毒理等研究证明不同晶型的安全和有效性时,应确证仿制药与原研药晶型的一致性;对于混晶药物,则应测试其晶型组成(种类、比例),并与已有标准的数据比较。
⑥ 含结晶水或结晶溶剂的药物 药物中的结晶水/溶剂或者吸附水/溶剂,可通过热分析研究,并结合干燥失重、水分测定或者单晶X-衍射测定,从而实现定性区分和准确定量测定的目的。
⑦ 多肽药物 质谱(全扫描和多级质谱)是多肽药物结构确证的重要手段。通过质谱测定、氨基酸残基分析、序列分析以及肽图测绘(含有20个以上氨基酸残基的药物)等实验,可获得多肽药物的结构信息。
药物结构中如有半胱氨酸,应明确其状态(氧化态或还原态),对含有多个半胱氨酸的多肽药物,应明确二硫键的正确连接位点。
如果各步中间体均进行了质谱测定,可根据相关中间体的结构信息,推测出进行反应的氨基酸的种类。
此外,还应对多肽药物的化学纯度、手性结构信息(对映体或非对映体纯度)进行研究。混合多肽应采用联用技术进行分离和鉴定确证。
⑧ 多糖类药物 应采用凝胶色谱等,对多糖的分子量及其分布进行测定;应鉴定单糖组成和比例、糖苷键连接方法和连接位置等关键结构信息,以确证多糖类药物的结构。
质谱、核磁共振、化学反应分析等实验,有助于确定糖苷键的连接方式及糖苷键的位置。
⑨ 多组分药物 多组分药物,既要对其各组分进行结构确认,还必须明确各组分的组成比例和组分间可能的相互作用,以便结构和组成的确证与质控。
2.主要测试项目与结构信息
(1)元素组成
对于有机药物通常采用元素分析法测定其C、H、N、S等元素的组成和含量。元素分析法的原理是:供试品(约2mg)在纯氧氛围下燃烧并催化转化为气态的CO2、H2O、N2与SO2,然后通过吹扫捕集吸附和气相色谱分离,经热导检测器检测和标准对照,即可测得各个元素的含量。比较测定值和理论值的差异,即可判定供试品与目标药物的分子结构是否一致。一般要求各元素百分含量的误差不超过0.3%,即认为结构一致。图4-2为药物单体青蒿素的元素分析报告。
图4-2 药物单体青蒿素的元素分析报告
由于受仪器的系统偏差、称量误差与吸湿变化、样品纯度等影响,元素分析实际结果常常与理论值存在超过0.3%的偏差。所以,虽然元素分析结果作为经典的结构鉴定项目在药物结构的确证中具有参考价值,但是需要结合更为专属的质谱等测定进行确证。
(2)质谱(MS)
将药物分子离子化后进行质谱分析,是用于分子量和分子式测定、同位素分析或定性定量分析的重要光谱技术。药物质谱分析获得的重要结构信息包括:分子离子峰、碎片离子峰、同位素离子峰及相对丰度等。
分子离子峰是确证药物分子式的有力证据。高分辨质谱通过精密测定分子离子的准确质量,可直接确定药物的分子式(图4-3)。对于因药物自身结构特征的原因,而难以准确进行元素分析时,在保证高纯度的情况下,可采用高分辨质谱法测定药物分子结构(母离子)的元素组成。
图4-3
图4-3 齐洛那平丁二酸盐的ESI-TOF高分辨一级质谱图(a)、
元素组成鉴定(b)、二级质谱(c)与裂解(d)
所以,应根据药物自身的结构特性,选择适宜的离子化方法进行质谱测定,以尽量获得稳定而可靠的分子离子峰响应。同时应采用适宜的质谱方法,进一步对能够反映药物结构单元特征的碎片离子峰进行测定——多级质谱法,以便通过质谱解析鉴定药物的结构。
对含有同位素丰度较强元素如Cl、Br、S等的药物,利用分子离子峰或特征碎片离子峰,以及它们相关同位素峰的相对丰度关系,可以判定药物中这些特殊元素组成的种类和数量。
但是,基于各种离子化技术的质谱分析法,不能反映药物的纯度和结晶水、结晶溶剂或残留溶剂等的情况。质谱联用技术和各种组合(多级)质谱方法,对药物的结构确证和药物的有关物质鉴定发挥着重要的作用。
(3)紫外吸收光谱(UV)
对药物稀溶液进行紫外-可见光区域(200nm~400nm~800nm)的吸收曲线扫描测定、主要吸收谱带(如K带、R带、E带、B带)的归属分析、摩尔/百分吸收系数的计算,可以获得药物结构中存在的发色团或助色团等共轭结构信息。这些共轭结构信息,既对结构鉴定有价值,同时也对药物定性鉴别有意义。图4-4为齐洛那平丁二酸盐在甲醇和0.1mol/L盐酸溶液中的UV吸收谱。
图4-4 齐洛那平丁二酸盐在甲醇(a)和0.1mol/L盐酸溶液(b)
中的UV吸收谱(浓度均10μg/mL)
对于结构中存在酸性或碱性基团的药物,通过酸性或碱性溶液中(常用0.1mol/L HCl 或0.1mol/L NaOH)最大吸收波长的测试与比较,分析蓝移或红移现象,可确证酸性或碱性基团是否为助色基团。
(4)红外吸收光谱(IR)
对药物进行红外吸收光谱(4000~400cm-1或2.5~25μm)测试与分析,可推测药物结构中可能存在的主要官能团(4000~1300cm-1官能团区)、极性价键及其初步的连接方式。有时也可获得药物的几何构型、晶型、立体构象等信息(1300~400cm-1指纹区)。
图4-5为齐洛那平丁二酸盐的红外吸收光谱。
图4-5 齐洛那平丁二酸盐的红外吸收光谱特征
固态药物红外吸收光谱测试可分为压片法、糊法、薄膜法;液态药物可采用液膜法测试;气态药物则可采用气体池测定。
对于部分含多晶型药物,在研磨和压片过程中,其晶型可能发生变化,可改用糊法测定,同时应根据药物的结构特点对糊剂的种类进行选择。
盐酸盐药物在采用KBr 压片时可能会发生离子交换现象,应分别对氯化钾压片和溴化钾压片法测得的结果进行比较,并根据结果选择适宜的压片基质。
(5)核磁共振谱(NMR)
药物结构中磁性原子核(1H、13C、19F、31P和15N)的核磁共振谱与各核的类型、数目、相互连接方式、周围化学环境甚至空间排列等骨架结构信息密切相关。所以,通过NMR谱的测定,可以确证药物结构中存在的骨架单元、官能团以及它们的连接方式,即药物结构。
常用的一维核磁共振谱有1H-NMR和13C-NMR等,主要结构信息包括:化学位移(δ)、偶合常数(J值)、偶合作用、裂分峰形和积分面积等。
1H-NMR可测得药物结构中不同类型氢原子的数目、周围化学环境、相互间关系、空间排列等结构信息。溶剂峰或部分溶剂中的溶剂化水峰,对药物结构中的部分信号可能会产生干扰。因此,NMR测试时,应选择适宜的溶剂和方法,避免药物信号受到干扰。对含有活泼氢的药物,必须进行重水(D2O)交换实验,以确证活泼氢的信息。图4-6为齐洛那平丁二酸盐的1H-NMR谱。
图4-6 齐洛那平丁二酸盐在DMSO-d6中的1H-NMR谱
13C-NMR可以测得药物结构中不同类型碳原子的数目、类型及其所处化学环境的结构信息;DEPT谱可进一步明确区分碳原子的类型。图4-7为齐洛那平丁二酸盐的13C-NMR谱、DEPT谱及归属。
图4-7
图4-7 齐洛那平丁二酸盐在DMSO-d6中的13C-NMR、DEPT谱及归属
对于结构复杂或用一维NMR 方法难以确证结构的药物,进行二维NMR谱测试与解析,可更有效地确证药物的结构。
常用二维核磁共振谱包括:测定分子结构中邻近质子间偶合相关的1H-1H COSY谱、质子-13C核间直偶相关的1H-13C HSQC和质子-13C核间远程偶合相关的1H-13C HMBC等。
例如,图4-8为齐洛那平丁二酸盐在DMSO-d6中的二维核磁共振谱。
图4-8 齐洛那平丁二酸盐在DMSO-d6中的COSY、HSQC和HMBC谱
因此,基于偶合相关的二维NMR,提供了分子骨架结构中H和C核的直接连接和邻近关系,简化了复杂一维图谱的解析难度;结合化学位移和偶合裂分,可以更直观地判别出分子结构中H和C核的归属。例如,DMSO-d6溶剂中齐洛那平丁二酸盐的1H-NMR和13C-NMR化学位移归属如下:
DMSO-d6溶剂中齐洛那平丁二酸盐1H-NMR化学位移归属
DMSO-d6溶剂中齐洛那平丁二酸盐13C-NMR化学位移归属
此外,NOE或NOESY试验通过药物刚性结构(或优势构象)官能团上质子的选择性照射,致使与其邻近的相关质子峰强度的增减和相互间偶合作用的消失,可确证某些邻近官能团的空间优势构象或构型信息。因此,可以用于药物立体构型的确证。
若分子结构中含F、P等元素的药物,可进行相应的F、P谱测试,除可提供相应元素的种类、在分子中所处的化学环境等结构信息外,对药物元素组成的鉴定亦有佐证作用。
15N-NMR的测试对于生物大分子的结构分析鉴定具有重要作用,见图4-9、图4-10。
图4-9 14N-和 15N-NMR共振峰的差异与不同型15N-NMR化学位移
图4-10 硫酸庆大霉素在水中的15N-NMR谱(36.48MHz,0.3mol/L)
(6)X-射线衍射(XRD)
固体物质的状态可分为晶态(或称晶体)和非晶态(或称无定型态、玻璃体等)两大类。晶态物质(晶体)中的分子、原子或离子在三维空间呈周期性有序排列,晶体的最小重复单位是晶胞。非晶态物质(无定型态、玻璃体等)中的分子、原子或离子在三维空间不具有周期性排列规律,其固体物质是由分子、原子或离子在三维空间无序堆积而成。当单色X-射线照射到晶态物质上时,可以产生衍射效应;而当X-射线照射到非晶态物质上时则无衍射效应。
单晶X-射线衍射法(SXRD)的测检对象为单晶物质(尺寸0.1~1mm),可测得化合物的分子构型和构象等立体结构信息,主要包括:空间群、晶胞参数、分子式、结构式、原子坐标、成键原子的键长与键角、分子内与分子间的氢键、盐键、配位键等。单晶X-射线衍射技术是定量检测样品成分与分子立体结构的绝对分析方法。它可独立完成对样品的手性或立体异构体分析、共晶物质分析(含结晶水或结晶溶剂等)、纯晶型物质分析(分子排列规律变化)等。由于单晶X-射线衍射分析实验使用一颗晶体,所以采用该分析法可获得晶型纯品物质信息。图4-11为齐洛那平丁二酸盐的SXRD分子结构椭球图和晶胞堆积图。
图4-11
粉末X-射线衍射法(PXRD)的测检对象为众多随机取向的固体粉末颗粒物质(晶体或非晶体)。晶态物质的粉末X-射线衍射峰是由数十乃至上百个锐峰(窄峰)组成;而非晶态物质的粉末X-射线衍射峰的数量较少且呈弥散状(为宽峰或馒头峰),在定量检测时,两者在相同位置的衍射峰的绝对强度值存在较大差异。图4-12(c)为齐洛那平丁二酸盐的PXRD谱。
图4-11 齐洛那平丁二酸盐的SXRD分子结构椭球图和晶胞堆积图
粉末X-射线衍射法适用于对晶态物质或非晶态物质的定性鉴别与定量分析。该法常用于固体药物的结晶度定性检查、多晶型种类、晶型纯度分析、晶型稳定性研究等。在粉末X-射线衍射实验中,通常使用Cu靶为阳极靶材料。当固体药物有两种或两种以上的不同固体状态时,即存在多晶型(或称为同质异晶)现象。多晶型现象可以由样品的分子构型、分子构象、分子排列规律、分子作用力等的变化引起,也可由结晶水或结晶溶剂的不同(数量与种类)而形成。每种晶型均应有特征的粉末X-射线衍射图谱。当被测样品的化学结构相同,但衍射峰的数量和位置、绝对强度值或衍射峰形几何拓扑间存在差别时,即表明该药物可能存在多晶型现象。
(7)热分析(TA)
对药物进行热分析实验,既可以确证药物自身的热稳定性属性,又可以鉴定药物中可能含有的结晶/吸附水或溶剂的状态。常用热分析方法包括:差示扫描量热(DSC)、热重分析(TG)、干燥失重、水分测定等。
① 差示扫描量热 差热扫描量热法,也称差热分析,可以识别药物的结晶/吸附水或溶剂,以及熔点、多晶型和热焓值等信息,见图4-12(a)。
图4-12 齐洛那平丁二酸盐的DSC、TG和PXRD谱
② 热重分析 热重分析可获得药物的吸附/结晶水或溶剂信息,以及分降解温度等信息[图4-12(b)]。结合差热分析的结果,还可判断测试药物的熔点和熔融分解性质。
③ 干燥失重 干燥失重分析可以测得药物中含有的受热挥发性溶剂的总量。
④ 水分测定 水分测定可以获得样品中含水总量的信息(结晶水或吸附水)。
此外,单晶X-射线衍射也可提供药物中以结晶型式存在的水或溶剂的信息,包括结晶水或溶剂的种类、数量、存在方式等。
3.综合解析确证结构
对药物结构进行不同类型的光谱分析测试,可获得药物结构不同方面的特征信息。针对不同方面信息进行综合分析、解析与汇总,才能够确证相应药物结构的完整特征。
所以,综合解析的目标就是确定各类不同结构信息的内在关联性,并证明相应药物分子结构的唯一性。综合解析应遵循“简明扼要”“有机”“合理”“深入”的原则。“简明扼要”是以简洁的语言给出不同方法对药物结构确证的结果,应避免过多的基本理论解释和繁杂的推导;“有机”是对不同方法所得的同一药物结构不同方面信息的综合归纳,以求获得药物较完整的结构信息;“合理”是对数据进行合理的归属、解析,不牵强附会;“深入”是在现有解析结果的基础上,根据相互间的关联特性关系,获得与药物结构有关的更针对性和专属性的信息,以获得对药物结构唯一性的完整确证。
对于仿制药物、已有文献报道的药物,可以利用文献数据或对照品平行测定数据等进行比对分析和相对简要的比对结构确证。此外,对原料药制备工艺的分析,也可为药物的结构确证,如立体构型特征等,提供间接的依据。