三、低氧通过抑制AMPK促进mTORC1-介导的表皮细胞迁移

本课题组前期研究发现，低氧可以促进角质形成细胞的运动能力。p70S6K、4EBP1是雷帕霉素靶蛋白mTORC1的下游作用靶点，与mRNA加工、蛋白质合成及细胞的生长、增殖等密切相关，是调节细胞功能状态的关键信号蛋白。这两个蛋白经磷酸化激活后结构发生改变，拥有生物活性，可发挥一系列功能。p-p70S6K、p-4EBP1是mTORC1通路激活的经典标志物，通过Western blot和细胞免疫荧光技术检测低氧处理后角质形成细胞中上述标志物的表达变化，结果表明低氧不影响总的P70S6K、mTOR蛋白的转录翻译表达，可显著增加细胞中p-p70S6K和p-4EBP1的表达，这种升高的趋势在低氧处理3小时后即可检测到，且呈时间依赖性，说明低氧激活细胞的mTORC1通路。

雷帕霉素（rapamycin）是mTORC1的经典抑制剂，可与细胞内FKBP12结合形成复合物，从而抑制mTORC1的活性。证明低氧可以激活mTORC1之后，选择6小时为低氧时间，利用雷帕霉素反向调控其活性，结果表明p70S6K、4EBP1总蛋白表达水平不受低氧及雷帕霉素处理的影响。mTORC1包括mTOR、Raptor、mLST8等多种蛋白，其中Raptor是mTORC1独有的组成成分。使用慢病毒作为载体敲减Raptor，建立效果明显、稳定性好的敲减细胞后，mTORC1活性显著受抑。

通过活细胞工作站研究抑制该蛋白活性对单个细胞运动能力的影响，发现正常细胞的运动轨迹集中靠近其各自的起始位置，范围较小，低氧处理则促使细胞的运动范围增加，这与低氧促进细胞运动性的结论一致。加入雷帕霉素处理后，细胞的运动范围明显减小，而敲减Raptor的细胞在接受低氧处理后运动范围也较小。说明无论通过化学药物还是基因手段，抑制mTORC1活性都会引起单个角质形成细胞的运动能力下降（图5-9）。利用划痕实验研究mTORC1失活对单层细胞侧向迁移能力的影响，发现经过24小时的观察后，正常对照组（N组）的细胞通过侧向迁移覆盖了原划痕区域的45%，低氧的细胞对划痕区域的覆盖面积明显增加，抑制mTORC1活性可抑制单层细胞的侧向迁移。

图5-9　mTORC1失活对单个角质形成细胞运动能力的影响

A.抑制mTORC1活性后表皮细胞运动轨迹图；B.抑制mTORC1活性后对原代表皮细胞及HaCaT细胞运动轨迹速度影响统计图。*.P<0.05vs.N组；#.P<0.05vs.H6+DMSO组；##.P<0.05vs.H6+shNC组。

既往报道中低氧对mTORC1的影响结论不一，部分研究发现低氧可抑制mTORC1，亦有研究指出低氧的肿瘤细胞中mTORC1处于激活状态，提示mTORC1在不同的处理措施和细胞类型中可能受到不同通路的调节。许多文献指出AMPK作为上游信号，可调节mTORC1的状态。p-AMPK、p-ACC是AMPK激活的经典标志物。低氧不影响AMPK的转录翻译表达，可显著降低细胞中p-AMPK和p-ACC的表达，这种下降的趋势在低氧处理3小时后即可检测到，且呈时间依赖性，说明低氧可抑制AMPK通路。利用AMPK通路的经典激活剂活化AMPK，并检测mTORC1的变化，发现激活AMPK通路可抑制mTORC1。同样通过活细胞工作站观察发现AMPK激活可抑制表皮细胞单个细胞运动能力及单层角质形成细胞侧向迁移速率。